يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على السؤال حول كيفية تأثير تكامل الفيروس الفيروس الفيروس التعبير الجيني أندروجينوس، ولماذا يتم اختيار بعض مواقع التكامل الجينومي في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في الآونة الأخيرة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنتاج نماذج في المختبر للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية، والتي تحمل مراسلين محترفين للفيروسات يستهدفون مواقع الاندماج المختارة باستخدام هندسة الجينوم القائمة على CRISPR/Cas9. إثبات الإجراء سيكون توماس والثر، طالب دكتوراه، وجوليا بياليك، ما بعد الدكتوراه من مختبري.
ابدأ باستخدام UCSC Genome Browser لاستخراج التسلسل الجينومي للملغة الجينومية المطلوبة. لاختيار RNAs دليل من 20 النيوكليوتيدات لاستهداف من المكبس الجينومية المختارة، استخدم أداة ويب E-CRISP. ثم حدد، الإنسان العاقل الجينوم المرجعي كونسورتيوم الجينوم البشري:بناء 38.
الجينوم المرجعي ككائن حي ومدخل 2000 أزواج قاعدة من التسلسل الجينومي، تغطي موضع الجينوم المطلوب الذي سبق استخراجه. بدء البحث دليل RNA باستخدام إعدادات التطبيق المتوسط مع أي PAM، أي خمسة رئيس الوزراء قاعدة، خارج الأهداف تتسامح مع عدم التطابق واستبعد introns وجزر CPG. من القائمة مع التصاميم دليل-RNA التي تظهر، حدد دليل الجيش الملكي النيبالي مع درجة عالية لخصوصية وكفاءة، وهو أقرب ما يمكن إلى مكان الجينوم المطلوب أن تكون مستهدفة.
فتح متصفح انفجار NCBI لتفجير تسلسل الدليل-RNA المختار ضد الجينوم المرجعي. للتحقق من تفرد موقع الربط الدليل-RNA المحدد، حدد أولاً الإنسان كمجين ومن ثم إدخال تسلسل الدليل-RNA كتسلسل الاستعلام. ثم حدد تسلسلات مشابهة للغاية أو انفجار ميجا كما البرنامج للتأكد من أن تسلسل دليل الجيش الملكي النيبالي هي فريدة من نوعها.
بعد ذلك، حدد في-silico 1، 000 أزواج قاعدة، المنبع والمصب من تسلسل دليل الجيش الملكي النيبالي من تسلسل الجينوم المستخرجة في البداية. استخدم هذه الأزواج 1000 قاعدة المختارة، المنبع والمصب كأسلحة homology خمسة رئيس وثلاثة أولي لاستهداف البناء ناقلات ومتجاورة مراسل تسلسل أن تكون مستهدفة. قبل 24 ساعة من نقل الخلايا التائية jurkat، إعداد واحد لوحة كاملة 6-جيدا من الخلايا لتجربة استهداف واحدة.
لبدء, لوحة 1, 250, 000 الخلايا في 2.5 ملليلتر من 1640 RPMI مع المكملات الغذائية ودون المضادات الحيوية, في بئر. في اليوم التالي، إضافة إلى ميكروغرام من ناقلات استهداف دائري واثنين من ميكروغرام من Cas9 ودليل RNA التعبير plasmid في كل بئر، إلى 250 ميكرولترات من المتوسط التجاري RPMI الأمثل لtransfection، في أنبوب رد فعل ومزيج جيد من قبل دوامة. ثم إضافة ببطء 12 ميكرولترات من عامل transfection إلى وسيط الحمض النووي دون لمس جدار الأنبوب.
نفض الغبار الأنبوب واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة الخليط قطرة إلى بئر واحد من الخلايا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
وبعد 72 ساعة من العدوى، اسحب الخلايا المُزوّرة، عدّها، واستعدّ للإثراء بواسطة القوات المسلحة الكونغولية. بعد التأكد من أحداث الاستهداف في مجموعات الخلايا المستهدفة المختلطة ، ابدأ في توليد مستنسخات خلايا واحدة عن طريق إعداد وسيط مكيف بالجونكات مقدمًا ، من خلال جمع RPMI مع المضادات الحيوية من الخلايا التائية السليمة وغير المعالجة. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق في 300 G، وتصفية فائقة مع حقنة 25 ملليلتر، وذلك باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر في أنابيب مخروطية جديدة، 50 ملليلتر.
عد الخلايا المستهدفة التي تم إثراؤها سابقًا بواسطة FACS ، بعد 10 إلى 14 يومًا من التوسع ، ثم تمييعها في RPMI بالمضادات الحيوية إلى تركيز 100،000 خلية لكل ملليلتر. تمييع 100 ميكرولترات من هذه الخلية تخفيف مع 9.9 ملليلتر من المتوسطة لتحقيق 1،000 خلية لكل ملليلتر. ثم تمييع مليلتر واحد من هذا التخفيف مع تسعة ملليلتر من متوسطة إلى تركيز 100 خلية لكل ملليلتر.
لوحة 96 لوحة جيدا لاحتواء خلية واحدة في البئر، مزيج بلطف ملليلتر واحد من 100-الخلايا في مليلتر حل مع خمسة ملليلتر من متوسطة الشرط وأربعة ملليلتر من المتوسطة الطازجة، في خزان كاشف معقم. ثم، استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولترات من تخفيف الخلية المعنية في بئر من جديد 96 جيدا جولة لوحات أسفل لتحقيق واحد واثنين من الخلايا في تخفيف جيدا. كومة 96 لوحات جيدا وتغطية كل كومة مع لوحة ستة جيدا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني في بئر.
احتضان اللوحات في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، لمدة ثلاثة أسابيع. بعد الانتهاء من الحضانة، وتأكيد بصريا وجود المستعمرات نمت باستخدام المجهر الخفيفة مع التكبير أربع مرات، ووضع علامة على الآبار مع المستعمرات نمت. بلطف resuspend الخلايا واحدة ملحوظ جيدا عن طريق الأنابيب.
نقل 100 microliters من هذا التعليق الخلية في بئر واحدة من الطازجة أعدت 96 جيدا لوحة أسفل جولة مع 100 ميكرولترات من RPMI مع المضادات الحيوية، في بئر وتكرار لجميع الآبار ملحوظ، مزيج بلطف عن طريق الأنابيب. لتكرار لوحة، نقل 100 ميكرولترات من هذا التعليق الخلية إلى لوحة فارغة ثانية، 96 جيدا جولة القاع وتكرار هذه العملية لجميع الآبار ملحوظ. وأخيراً، املأ الآبار الفارغة بـ 200 ميكرولتر من المضادات الحيوية في الـ RPMI.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد أن حضن لوحة مكررة لمدة 24 إلى 48 ساعة تكرار مرة أخرى عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من RPMI مع المضادات الحيوية إلى كل بئر. استخدام ماصة متعددة القنوات لخلط بلطف ونقل 100 ميكرولترات إلى كل بئر من لوحة جديدة 96 جيدا جولة القاع.
ضع واحدة من هذه اللوحتين المكررتين في الحاضنة. استخدم الثاني من اللوحات المكررة الجديدة لعملية استئصال الخلايا المتدفقة ، عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من PMA / Ionomycin Master Mix لكل بئر ، لتحفيز الخلايا. احتضان لمدة 24 ساعة وإعداد الخلايا لعملية استئصال الخلايا تدفق كما هو موضح في النص.
بوابة أي خلايا واحدة قابلة للحياة على أساس حجم في إلى الأمام والجانبية مبعثر. تحليل التعبير الجيني مراسل الفلورسنت حسب تدفق استئصال الدراجات. لفحص استنساخ خلية واحدة من قبل PCR، وتصميم التمهيدي P5 وP6 لفحص PCR على أساس تسلسل مراسل المختار، لتضخيم أزواج قاعدة 500 إلى 800 من تسلسل مراسل.
للتحكم الإيجابي PCR، تصميم التمهيدي P7 و P8 التي تضخيم أزواج قاعدة 630 من نوع البرية، والملصاص الجينومية غير المستهدفة. تصميم زوج التمهيدي الثالث الذي يضخم أزواج قاعدة 500 إلى 600 من العمود الفقري المستهدفة الموجهة كتحكم في التكامل غير المحدد لتسلسلات العمود الفقري المستهدفة المتجهة. مرة واحدة في استنساخ في لوحة مكررة الثانية نمت بما فيه الكفاية، وإعدادها لفحص PCR عن طريق الطرد المركزي أولا لوحة لمدة 10 دقيقة في 300-G في درجة حرارة الغرفة.
اخلع بعناية المُندفع، مع التأكد من عدم إزعاج بيليه الخلية. اغسل الخلايا بـ 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عن طريق الأنابيب اللطيفة ، وتجف اللوحة لمدة خمس دقائق عند 300 جرام في درجة حرارة الغرفة. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل في بئر.
الماصات بلطف لخلط، ونقل تعليق إلى لوحة PCR جديدة. ختم لوحة مع فيلم البارافين واحتضان لمدة ساعة واحدة في 55 درجة مئوية في ثيركلوسير. بعد الطرد المركزي أسفل حطام الخلية في السرعة القصوى لمدة 10 دقائق، نقل فائقة إلى لوحة PCR جديدة.
إضافة 10 ميكرولترات من هذه الخلية lysate إلى كل بئر من 96 جيدا PCR لوحة مليئة 110 ميكرولترات من H2O المقطر، في بئر. ثم احتضان لمدة 10 دقائق في 99 درجة مئوية في thermocycler، لتنشيط البروتينات K.Use 2 microliters من هذه الخلية lysate كقالب واستخدام مزيج رئيسي PCR التجارية للفحص، والسيطرة والعمود الفقري PCR. تشغيل PCR لمدة 38 إلى 40 دورات من تضخيم PCR في شكل 96-جيدا.
استخدام خمسة microliters من منتجات PCR وتشغيلها على 1.5٪ agarose TAE هلام لتحليل والجمع بين تدفق cytometry ونتائج PCR، لتأكيد استنساخ خلية واحدة. تم تأكيد التعبير الجيني لمراسل بعد PMA / Ionomycin التعريفي من قبل كل من تدفق استئصال الخلايا وPCR في أربعة إلى 12 ٪ من الخلايا ، اعتمادا على موقع التكامل. إن تحليل PCR للحمض النووي الجينومي باستخدام الزهَم الخماسية و الثلاثة اُبرى للدمج، يؤكد أن أحداث الاستهداف قد وقعت.
بعد فحص استنساخ خلية واحدة لاستهداف الصحيح عن طريق تدفق cytometry، لوحظ استنساخ مع عالية ومنخفضة ولا التعبير الجيني مراسل الفلورسنت. كما تم تأكيد استنساخ خلايا واحدة من قبل PCR باستخدام التمهيديات الخاصة بمراسل معين وابتداخ التحكم. تم إنفاق المستنسخين المؤكدين إيجابيين في فحص PCR وتم تحليلهم بشكل أكبر من أجل الاستهداف الصحيح من قبل البقعة الجنوبية ، باستخدام مسبار خاص بمراسل ومسبار الجينوم الملزم خارج المراسل.
أظهر جزء فقط أحجام النطاق الصحيح في تحليل البقعة الجنوبية وكان قد دمج المراسل بشكل غير ترددي ، مما يدل على أنه من المهم التحقق من نتائج PCR بواسطة لطخة الجنوبي. كما تم تحليل المستنسخات عن طريق التسلسل للتأكد من صحة النسخ الموجبة من الخلايا الواحدة. تسلسل الموقع المستهدف: أليل homologous، إذا كان المراسل لم تتكامل، وكشفت الطفرات التي تسببها Cas9.
وبمجرد أن يتقن، يمكن إنجاز إنشاء خطوط مراسلي فيروس نقص المناعة البشرية في غضون شهرين إلى ثلاثة أشهر. قبل الاستهداف ، من المهم قضاء وقت كاف في اختيار موقع التكامل والمراسل المناسب ، اعتمادًا على سؤال البحث الذي ترغب في معالجته. ويمكن للمراسلين على سبيل المثال أن يشملوا عناصر تنظيمية مختلفة بشأن فيروس نقص المناعة البشرية إذا رغبت في ذلك.
بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام خطوط الخلية على سبيل المثال، لاختبار تأثير عوامل تزايد زمن الوصول المختلفة على النشاط النسخي للمراسل LTR، اعتماداً على موقع التكامل الخاص به. بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد التكامل موقع محدد فيروس نقص المناعة البشرية مراسل خطوط لتصميم دليل RNAs واستهداف ناقلات، وأداء CRISPR / Cas9 المستندة إلى هندسة الجينوم في خلايا jurkat، وإنتاج استنساخ خلية واحدة واختيار لاستنساخ المستهدفة بشكل صحيح من قبل FACS وفحص PCR. لا تنس، أنه إذا اخترت العمل مع مراسل فيروس نقص المناعة البشرية المختص بالتكرار، فأنت بحاجة إلى العمل في ظل ظروف السلامة BSL3.
