この方法は、HIVプロウイルスの統合がアンドロギヌス遺伝子発現にどのような影響を与えるのか、そしてなぜ最近HIV感染細胞で特定のゲノム統合部位が選択されているのかという疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、CRISPR/Cas9ベースのゲノム工学を使用して選択された統合部位を標的としたプロウイルスレポーターを運ぶHIV感染のためのインビトロモデルを産生することができるということです。この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生であるトーマス・ワルサーと、私の研究室のポスドクであるジュリア・ビアレクです。
まず、UCSCゲノムブラウザを使用して、標的とするゲノム軌跡のゲノム配列をインシリコ抽出します。選択したゲノム軌跡を標的とする20ヌクレオチドの誘導RNAを選択するには、E-CRISPウェブツールを使用する。次に、ホモ・サピエンスゲノム参照コンソーシアムヒトゲノムを選択:Build 38.
ゲノムをゲノム配列の生物と入力2,000塩基対として参照し、以前に抽出した所望のゲノム軌跡をカバーする。PAM、5素数基、オフターゲットが不一致を許容し、除外されたイントロンおよびCPG島を備えた中規模アプリケーション設定を使用してガイドRNA検索を開始します。表示されるガイドRNA設計のリストから、標的とする望ましいゲノム遺伝子座に可能な限り近い特異性と効率に関する高いスコアを持つガイドRNAを選択します。
NCBI Blast ブラウザを開いて、選択したガイド RNA 配列を参照ゲノムに対してブラストします。選択したガイドRNA結合部位の一意性を確認するには、まずヒトをゲノムとして選択し、次にガイドRNA配列をクエリ配列として入力します。次に、非常に類似した配列またはメガブラストをプログラムとして選択し、ガイドRNA配列が一意であることを確認します。
その後、インシリコ1,000塩基対を選択し、最初に抽出したゲノム配列からガイドRNA配列の上流および下流を選択する。これらの選択された1,000塩基対を、上流および下流に対して、ターゲットとするベクトル構築および隣接レポーターシーケンスをターゲットとする5素数および3つの相同性アームとして使用します。ジュルカットT細胞のトランスフェクションの24時間前に、単一の標的実験のために細胞の完全な6ウェルプレートを1個調製する。
開始するには、プレート1、250、000細胞のRPMI 1640の2.5ミリリットルのサプリメントと抗生物質なし、井戸あたり。翌日、円形ターゲティングベクターのマイクログラムとCas9の2マイクログラムとガイドRNA発現プラスミドを井戸あたりに加え、トランスフェクション用に最適化された市販のRPMI培地の250マイクロリットルに、反応管で、渦によってよく混ぜます。その後、チューブの壁に触れることなく、12マイクロリットルのトランスフェクション剤をDNA培地にゆっくりと添加します。
チューブをフリックし、室温で15分間インキュベートします。細胞の1つの井戸に滴下混合物を追加します。37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。
トランスフェクションの72時間後、トランスフェクション細胞を引っ張り、それらを数え、FACSによる濃縮の準備をします。混合標的細胞集団における標的事象を確認した後、健康で未処理のジュルカトT細胞から抗生物質を含むRPMIを収集することによって、ジュルカト調整培地を事前に調製して単細胞クローンの生成を開始する。300Gで5分間チューブを遠心分離し、新しい50ミリリットル円錐形チューブに0.22マイクロメートルフィルターを使用して、25ミリリットルのシリンジで上澄み物を濾過します。
拡大後10~14日後にFACSによって以前に濃縮された標的細胞を数え、抗生物質でRPMIで希釈し、1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度にします。この細胞希釈液の100マイクロリットルを9.9ミリリットルの培地で希釈し、1ミリリットル当たり1,000細胞を達成する。その後、この希釈液の1ミリリットルを9ミリリットルの培地で1ミリリットルの濃度に希釈し、1ミリリットル当たり100細胞の濃度にします。
プレート96ウェルプレートには、1ウェルあたり1つのセルを含み、100細胞/ミリリットル溶液の1ミリリットルを5ミリリットルの状態培地と4ミリリットルの新鮮な培地と、滅菌試薬貯留層で穏やかに混合します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、新しい96ウェルの丸底プレートのウェルあたり、それぞれの細胞希釈液の100マイクロリットルを加え、ウェル希釈液あたり1個と2個の細胞を達成します。96ウェルプレートを積み重ね、各スタックに3ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートを覆います。
5%の二酸化炭素を加湿したインキュベーターで37°Cでプレートを3週間インキュベートします。インキュベーションを完了した後、4倍の倍率で軽い顕微鏡を使用して成長したコロニーの存在を視覚的に確認し、成長したコロニーで井戸をマークします。ピペット処理でよくマークされた1つの細胞を穏やかに再中断する。
この細胞懸濁液の100マイクロリットルを、抗生物質で100マイクロリットルのRPMIを備えた準備された96ウェルラウンドボトムプレートの1つの井戸に移し、すべてのマークされた井戸について繰り返し、ピペットで穏やかに混合します。プレートを複製するには、このセル懸濁液の100マイクロリットルを2番目の空の96ウェルラウンドボトムプレートに移し、すべてのマークされたウェルに対してこのプロセスを繰り返します。最後に、200マイクロリットルのRPMIを抗生物質で空の井戸に充填します。
プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートします。重複プレートが24〜48時間インキュベートされた後、すべての井戸に抗生物質でRPMIの100マイクロリットルを追加することによって、再びそれを複製します。マルチチャンネルピペットを使用して穏やかに混ぜ、新しい96ウェルの丸底プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。
これらの2つの重複したプレートの1つをインキュベーターに入れます。フローサイトメトリー用の新しい重複プレートの2番目を使用し、まずウェルあたり5マイクロリットルのPMA/イオノマイシンマスターミックスを追加して、細胞を刺激します。24時間インキュベートし、テキストに記載されているようにフローサイトメトリー用に細胞を調製する。
前方および横方向の散乱のサイズに基づいて、実行可能な単一の細胞をゲートします。フローサイトメトリーによる蛍光レポーター遺伝子発現解析PCRにより単細胞クローンをスクリーニングするために、選択したレポーター配列に基づいてPCRをスクリーニングするためのプライマーP5およびP6を設計し、レポーター配列の500〜800塩基対を増幅する。
ポジティブコントロールPCRの場合、野生型の非標的ゲノム軌跡の630塩基対を増幅するプライマーP7とP8を設計します。ターゲティング・ベクター・バックボーン配列の非特異的な統合のための制御として、ターゲティング・ベクター・バックボーンの500から600の塩基対を増幅する第3のプライマーペアを設計する。2番目の重複プレート内のクローンが十分に成長したら、まず室温で300-Gで10分間遠心してPCRスクリーニングに備えます。
上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを乱さないようにします。穏やかなピペットで100マイクロリットルのPBSで細胞を洗い、室温で300Gで5分間プレートを遠心します。PBSを取り除き、井戸あたり200マイクロリットルの溶菌バッファーを追加します。
ピペットを軽く混ぜ、新しいPCRプレートに移します。パラフィンフィルムでプレートを密封し、サーモサイクラーで摂氏55度で1時間インキュベートします。最大速度で細胞の破片を10分間遠心した後、上清を新しいPCRプレートに移します。
この細胞のライセートの10マイクロリットルを、110マイクロリットルの蒸留H2Oで満たされた96ウェルPCRプレートの各ウェルに加えます。次に、サーモサイクラーで摂氏99度で10分間インキュベートし、タンパク質を不活性化するK.この細胞ライゼの2マイクロリットルをテンプレートとして使用し、スクリーニング、制御および骨格PCRのための市販のPCRマスターミックスを使用します。PCR を 38 ~ 40 サイクルの PCR 増幅で 96 ウェル形式で実行します。
5マイクロリットルのPCR産物を使用し、1.5%アガロースTAEゲルで実行し、フローサイトメトリーとPCR結果を分析して組み合わせて、単一細胞クローンを確認します。PMA/イオノマイシン誘導後のレポーター遺伝子発現は、細胞の4~12%のフローサイトメトリーとPCRの両方により、統合部位に応じて確認した。5素子および3素積分結合のプライマーを用いたゲノムDNAのPCR解析は、ターゲティング事象が発生したことを確認した。
フローサイトメトリーによる正しい標的化のための単一細胞クローンのスクリーニング後、高、低、蛍光レポーター遺伝子発現がないクローンが観察された。単細胞クローンは、レポーター特異的プライマーおよび制御プライマーを用いたPCRによっても確認された。スクリーニングPCRで陽性を確認したクローンは、レポーター特異的プローブとレポーター外部のゲノムプローブ結合を用いて、サザンブロットによる正しい標的化のためにさらに分析された。
サザンブロット分析で正しいバンドサイズを示した部分のみで、レポーターをヘテロ接合的に統合し、サザンブロットによるPCR結果を検証することが重要であることを示した。クローンはまた、正の単細胞クローンをさらに確認するためにシーケンシングによって分析された。標的部位のシーケンシング:相同性アレーレは、レポーターが統合していなかったので、Cas9誘発突然変異を明らかにした。
一度習得すると、HIVレポーターラインの生成は2〜3ヶ月で達成することができます。ターゲット設定を行う前に、取り組みたい研究の質問に応じて、統合サイトと適切なレポーターを選択するのに十分な時間を費やしておくことが重要です。レポーターは、例えば、必要に応じて異なるHIV調節要素を含むことができる。
この手順に従って、細胞株は、例えば、その統合部位に応じて、レポーターLTRの転写活動に対する異なる遅延上昇剤の効果をテストするために使用することができる。このビデオを見た後、ガイドRNAとターゲティングベクターを設計し、ジュルカット細胞でCRISPR/Cas9ベースのゲノムエンジニアリングを行い、単一細胞クローンを産生し、FACSおよびPCRスクリーニングによって正しく標的化されたクローンを選択するための統合サイト特異的HIVレポーターラインを生成する方法をよく理解する必要があります。複製能力のあるHIVレポーターと一緒に作業することを選択した場合は、BSL3の安全条件の下で作業する必要があることを忘れないでください。
