이 방법은 HIV 프로바이러스 통합이 어떻게 ANDrogynous 유전자 발현에 영향을 미치는지, 그리고 왜 특정 게놈 통합 사이트가 최근 HIV 감염 된 세포에서 선택되는지에 대한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HIV 감염을 위한 체외 모형이 CRISPR/Cas9 기지를 둔 게놈 공학을 사용하여 선택한 통합 사이트에 표적으로 한 프로 바이러스 성 기자를 전송하는 생성될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 토마스 월터, 박사 과정 학생, 줄리아 비알렉, 내 실험실에서 포스트 독이 될 것입니다.
UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 표적화될 원하는 게놈 궤적의 게놈 서열을 실리코 추출물로 사용하여 시작한다. 선택한 게놈 궤적의 표적화를 위한 20개의 뉴클레오티드의 가이드 RNA를 선택하려면 E-CRISP 웹 도구를 사용합니다. 그런 다음, 호모 사피엔스 게놈 참조 컨소시엄 인간 게놈:빌드 38.
게놈을 게놈서의 유기체 및 입력 2, 000기쌍으로 참조하여 이전에 추출한 원하는 게놈 궤적을 덮는다. 모든 PAM, 모든 5 프라임 베이스, 오프 타겟과 중간 응용 프로그램 설정을 사용하여 가이드 RNA 검색을 시작 불일치를 허용하고 인트론과 CPG 섬을 제외. 나타나는 가능한 가이드 RNA 설계를 가진 목록에서, 표적화될 원하는 게놈 궤적에 가능한 한 가까운 특이성 및 효율성에 대한 높은 점수를 가진 가이드 RNA를 선택한다.
참조 게놈에 대해 선택한 가이드 RNA 서열을 폭발하는 NCBI 블라스트 브라우저를 엽니다. 선택한 가이드-RNA 결합 부위의 고유성을 확인하기 위해 먼저 인간을 게놈으로 선택한 다음 가이드-RNA 서열을 쿼리 서열로 입력한다. 그런 다음 가이드-RNA 서열이 고유한지 확인하기 위해 프로그램으로 매우 유사한 서열 또는 메가 블라스트를 선택합니다.
그 후, 처음에 추출된 게놈 서열으로부터 가이드-RNA 서열의 상류 및 하류인 실리코 1, 000염기 쌍을 선택한다. 이러한 선택된 1, 000베이스 쌍, 업스트림 및 다운스트림을 5프라임 및 3프라임 호모로지 암으로 사용하여 벡터 시공을 타겟팅하고 기자 시퀀스를 타겟팅합니다. jurkat T 세포의 변환 24 시간 전에, 단일 표적 실험을 위한 세포의 1개의 완전한 6-웰 플레이트를 준비합니다.
시작하려면, 플레이트 1, 250, 000 세포RPMI의 2.5 밀리리터 1640 보충제와 항생제없이, 잘 당. 다음 날, 원형 표적 벡터와 2마이크로그램의 Cas9 및 가이드-RNA 발현 플라스미드를 잘, 트랜스페션에 최적화된 상업용 RPMI 배지 의 250 마이크로리터에 반응 튜브에 추가하고 소용돌이에 의해 잘 혼합한다. 그런 다음 튜브의 벽을 만지지 않고 DNA 매체에 12 마이크로리터의 트랜스펙트 제를 천천히 추가합니다.
튜브를 플릭하고 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 혼합물을 하나의 우물에 드롭와이즈로 추가합니다. 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
그리고 72 시간 후 형질 전환 후, 전감염된 세포를 당겨, 그들을 계산하고 FACS에 의해 농축을 준비. 혼합 표적 세포 집단에서 표적 이벤트를 확인한 후, 건강하고 치료되지 않은 jurkat T 세포로부터 항생제로 RPMI를 수집하여 jurkat 조절 배지를 미리 준비하여 단일 세포 클론생성을 시작합니다. 300G에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 0.22 마이크로미터 필터를 새로운 50밀리리터 원유형 튜브로 사용하여 25 밀리리터 주사기로 수퍼네티를 필터링합니다.
이전에 FACS에 의해 농축된 표적 세포를 계산하고, 확장 후 10-14일 후에 항생제로 RPMI에서 희석하여 밀리리터당 100, 000 세포의 농도로 희석합니다. 밀리리터당 1, 000세포를 달성하기 위해 중간 크기의 9.9 밀리리터로 이 세포 희석제 100마이크로리터를 희석시합니다. 그런 다음 밀리리터 당 100 세포의 농도에 매체의 9 밀리리터와 이 희석의 1 밀리리터를 희석.
96개의 웰 플레이트를 플레이트에 음파1셀을 함유하고, 밀리리터 당 1밀리리터 1밀리리터를 5밀리리터의 상태 배지와 4밀리리터의 신선한 배지와 부드럽게 혼합하여 멸균 시약 저장소에 놓습니다. 그런 다음 다중 채널 파이펫을 사용하여 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 웰당 각 세포 희석제 100 마이크로리터를 추가하여 잘 희석당 1개 및 2개의 세포를 달성한다. 96 개의 웰 플레이트를 쌓고 각 스택을 6 웰 플레이트로 덮어 3 밀리리터의 PBS가 들어 있습니다.
3주 동안 5%의 이산화탄소를 가진 가습된 인큐베이터에서 37도의 플레이트를 배양합니다. 인큐베이션을 완료한 후, 4배 배율로 가벼운 현미경 검사를 사용하여 재배된 식민지의 존재를 시각적으로 확인하고, 재배된 식민지로 우물을 표시한다. 파이펫팅으로 잘 표시된 하나의 셀을 부드럽게 다시 중단합니다.
이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 항생제로 RPMI 100 마이크로리터와 함께 갓 준비된 96웰 라운드 하단 플레이트 1개에 옮기고, 모든 표시된 우물에 대해 반복하여 파이펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 플레이트를 복제하려면 이 셀 서스펜션의 100 마이크로리터를 두 번째 빈 96웰 라운드 하단 플레이트로 옮기고 표시된 모든 우물에 대해 이 과정을 반복합니다. 마지막으로, 항생제로 RPMI의 200 마이크로 리터로 빈 우물을 채웁니다.
플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 중복 플레이트가 24~48시간 동안 배양한 후 모든 웰에 항생제를 가진 RPMI의 100마이크로리터를 첨가하여 다시 복제합니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 100 마이크로 리터를 새로운 96웰 라운드 하단 플레이트의 각 웰에 전송합니다.
이 두 개의 중복 플레이트 중 하나를 인큐베이터에 넣습니다. 먼저 잘 당 PMA / 이오노마이신 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터를 추가하여, 유세포 측정에 대한 새로운 중복 플레이트의 두 번째를 사용하여 세포를 자극합니다. 24 시간 동안 배양하고 텍스트에 설명 된 바와 같이 유동 세포 측정에 대한 세포를 준비합니다.
전방 및 측면 분산의 크기를 기반으로 실행 가능한 단일 셀을 게이트합니다. 유동 세포측정에 의한 형광 기자 유전자 발현을 분석한다. PCR에 의해 단일 셀 클론을 선별하기 위해, 선택한 리포터 서열에 기초하여 PCR을 선별하기 위한 디자인 프라이머 P5 및 P6, 리포터 시퀀스의 500~800개의 기본 쌍을 증폭한다.
양포 제어 PCR의 경우, 설계 프라이머 P7및 P8은 630개의 기본 쌍을 야생형, 비표적 게놈 궤적으로 증폭시다. 타겟팅 벡터 백본 서열의 특이하지 않은 통합을 위한 컨트롤로 타겟팅 벡터 백본의 500~600개의 기본 쌍을 증폭시키는 세 번째 프라이머 쌍을 디자인합니다. 두 번째 중복 플레이트의 클론이 충분히 성장하면 실온에서 300-G에서 10 분 동안 플레이트를 원심분리하여 PCR 스크리닝을 준비하십시오.
조심스럽게 상체를 벗고 세포 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 부드러운 파이펫팅으로 PBS 100 마이크로리터로 셀을 세척하고 실온에서 300G에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. PBS를 제거하고 잘 당 200 마이크로리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.
파이펫을 부드럽게 섞고 서스펜션을 새로운 PCR 플레이트로 옮기습니다. 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 열사이클러에서 섭씨 55도에서 1시간 동안 배양합니다. 10분 동안 최대 속도로 셀 이물질을 원심분리한 후, 상체판을 새로운 PCR 플레이트로 옮긴다.
이 셀 용액 10 마이크로 리터를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 110 마이크로리터의 증류된 H2O로 채워 넣습니다. 그런 다음 열순환기에서 섭씨 99도에서 10분 동안 배양하여 이 셀의 단백질Ase K.Use 2 마이크로리터를 템플릿으로 비활성화하고 스크리닝, 제어 및 백본 PCR에 상업용 PCR 마스터 믹스를 사용합니다. PCR을 96웰 형식으로 38~40사이클의 PCR 증폭에 실행합니다.
PCR 제품의 5개의 마이크로리터를 사용하고 1.5%의 아가로즈 TAE 젤로 실행하여 유동 세포측정및 PCR 결과를 분석하고 결합하여 단일 세포 클론을 확인합니다. PMA/이오노마이신 유도 후 기자 유전자 발현은 통합 부위에 따라 세포의 4~12%에서 혈류 세포및 PCR 모두에 의해 확인되었다. 5-프라임 및 3-프라임 통합 접합을 위한 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 PCR 분석은 표적 이벤트가 발생했는지 확인합니다.
유동 세포측정에 의한 올바른 표적화를 위한 단일 세포 클론의 스크리닝 후, 높은, 낮음 및 형광 기자 유전자 발현이 없는 클론이 관찰되었다. 단일 셀 클론은 또한 리포터 특정 프라이머 및 제어 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인되었다. 클론은 기자 특정 프로브와 기자 외부의 게놈 프로브 바인딩을 사용하여 남부 블롯에 의한 올바른 표적화를 위해 PCR 검사를 양성으로 확인했습니다.
남부 블롯 분석에서 올바른 대역 크기만 보였고, 이종수구우스가 기자를 통합하여 남부 블롯에 의해 PCR 결과를 확인하는 것이 중요하다는 것을 보여주었습니다. 클론은 또한 양양성 단세포 클론을 더 확인하기 위해 시퀀싱에 의해 분석되었다. 대상 부위의 시퀀싱:상동성 적선, 기자가 통합되지 않았고, Cas9 유도 돌연변이가 밝혀졌다.
일단 마스터되면, HIV 기자 라인의 생성은 2 ~ 3 개월 안에 달성 될 수있다. 타겟팅하기 전에 해결하려는 연구 질문에 따라 통합 사이트와 적절한 리포터를 선택하는 데 충분한 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 기자는 예를 들어 원하는 경우 다른 HIV 규제 요소를 포함할 수 있습니다.
이 절차에 따라, 세포주 예를 들어, 통합 부위에 따라 리포터 LTR의 전사 활동에 대한 상이한 대기 시간 상승 제의 효과를 테스트하는 데 사용될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 가이드 RNA 를 설계하고 벡터를 타겟팅하고, JUrkat 세포에서 CRISPR/Cas9 기반 게놈 엔지니어링을 수행하고, 단일 셀 클론을 생성하고, FACS 및 PCR 스크리닝에 의해 올바르게 표적화된 클론을 선택하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 복제 능력이 있는 HIV 리포터와 함께 일하기로 선택한 경우 BSL3 안전 조건하에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
