שיטה זו יכולה לעזור לענות על השאלה כיצד אינטגרציה של נגיף האיידס משפיעה על ביטוי גנים אנדרוגיניים, ומדוע אתרי אינטגרציה גנומיים מסוימים נבחרים לאחרונה בתאים נגועים ב- HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מודלים במבחנה לזיהום HIV, הנושאים כתבים פרו-ויראליים המיועדים לאתרי אינטגרציה נבחרים באמצעות הנדסת גנום מבוססת CRISPR/Cas9. הדגימו את ההליך יהיו תומאס ולטר, דוקטורנט, וג'וליה ביאלק, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלי.
התחל על ידי שימוש בדפדפן הגנום UCSC כדי in-silico-לחלץ את הרצף הגנומי של לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד. כדי לבחור RNAs מנחים של 20 נוקלאוטידים לפילוח של הלוקוס הגנומי שנבחר, השתמש בכלי האינטרנט E-CRISP. לאחר מכן בחר, הומו ספיינס גנום הפניה קונסורציום הגנום האנושי:לבנות 38.
התייחסות הגנום כמו האורגניזם קלט 2, 000 זוגות הבסיס של הרצף הגנומי, מכסה את לוקוס הגנומי הרצוי שחולץ בעבר. התחל חיפוש מדריך-RNA באמצעות הגדרות יישום בינוני עם כל PAM, כל בסיס חמישה ראשים, מחוץ ליעדים לסבול אי התאמות ולא נכללו introns ואיי CPG. מהרשימה עם עיצובים RNA מדריך אפשרי שמופיע, בחר RNA מדריך עם ציון גבוה עבור ספציפיות ויעילות, אשר קרוב ככל האפשר לוקוס הגנומי הרצוי להיות ממוקד.
פתח את דפדפן NCBI Blast כדי לפוצץ את רצף המדריך-RNA שנבחר נגד גנום הייחוס. כדי לבדוק את הייחודיות של אתר איגוד ה- Guide-RNA שנבחר, בחר תחילה את האדם כגנום ולאחר מכן הזן את רצף ה- RNA של המדריך כרצף השאילתה. לאחר מכן בחר רצפים דומים מאוד או פיצוץ מגה כתוכנית כדי לוודא כי רצף RNA המדריך הוא ייחודי.
לאחר מכן, בחר ב-silico 1, 000 זוגות בסיס, במעלה הזרם ובמורד הזרם של רצף Guide-RNA מהרצף הגנומי שחולץ בהתחלה. השתמש ב-1,000 זוגות בסיסים נבחרים אלה, במעלה הזרם ובמורד הזרם כזרועות הומולוגיה של חמישה ראשים ושלושה ראשים כדי להתמקד בבנייה וקטורית וברצף הכתבים הסמוך כדי להיות ממוקדים. 24 שעות לפני ההמרה של תאי T jurkat, להכין צלחת אחת שלמה 6 באר של התאים לניסוי מיקוד יחיד.
כדי להתחיל, צלחת 1, 250, 000 תאים ב 2.5 מיליליטר של RPMI 1640 עם תוספי מזון וללא אנטיביוטיקה, לגם. ביום שלמחר, להוסיף מיקרוגרם של וקטור מיקוד עגול ושני מיקרוגרם של Cas9 ו plasmid ביטוי מדריך-RNA ל הבאר, כדי 250 microliters של מדיום RPMI מסחרי אופטימיזציה עבור transfection, בצינור תגובה לערבב היטב על ידי מערבולת. ואז לאט להוסיף 12 microliters של סוכן transfection למדיום ה-DNA מבלי לגעת בקיר של הצינור.
מצליפים בצינור ומטגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים את התערובת dropwise ל באר אחת של תאים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
ו-72 שעות לאחר ההתמזגות, משוך את התאים המותבים, ספור אותם והתכונן להעשרה על ידי FACS. לאחר אישור אירועי המיקוד באוכלוסיית התאים הממוקדים המעורבים, התחל לייצר שיבוטים של תאים בודדים על ידי הכנת מדיום ממוזג מראש, על ידי איסוף RPMI עם אנטיביוטיקה מתאי T בריאים ולא מטופלים. צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 300 G, ולסנן את supernatant עם מזרק 25 מיליליטר, באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22 לתוך חדש, 50 צינורות חרוט מיליליטר.
לספור את התאים הממוקדים שהועשרו בעבר על ידי FACS, 10 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות, ולאחר מכן לדלל אותם RPMI עם אנטיביוטיקה לריכוז של 100, 000 תאים למיליליטר. לדלל 100 microliters של דילול תא זה עם 9.9 מיליליטר של בינוני כדי להשיג 1, 000 תאים למיליליטר. ואז לדלל מיליליטר אחד של דילול זה עם תשעה מיליליטר של בינוני לריכוז של 100 תאים למיליליטר.
כדי צלחת 96 צלחות גם להכיל תא אחד ל הבאר, בעדינות לערבב מיליליטר אחד של תותב 100 תאים למיליליטר עם חמישה מיליליטר של בינוני מצב וארבעה מיליליטר של בינוני טרי, במאגר בריאגנט סטרילי. לאחר מכן, השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 100 microliters של דילול התא המתאים ל הבאר של 96 גם צלחות תחתונות עגולות 96 היטב כדי להשיג אחד ושני תאים לדילול היטב. עורמים את 96 צלחות באר ומכסים כל ערימה עם צלחת שש בארות המכילה שלושה מיליליטר של PBS לגם.
דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני, במשך שלושה שבועות. לאחר הדגירה הושלמה, חזותית לאשר את נוכחותם של מושבות גדל באמצעות מיקרוסקופ אור עם הגדלה ארבע פעמים, ולסמן את בארות עם מושבות גדל. בעדינות resuspend תאים של אחד מסומן היטב על ידי צינורות.
העבר 100 microliters של מתלה תא זה לתוך באר אחת של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב מוכן טרי עם 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה, ל הבאר ולחזור על כל הבארים המסומנים, לערבב בעדינות על ידי pipetting. כדי לשכפל את הצלחת, להעביר 100 microliters של ההשעיה תא זה לתוך צלחת שנייה ריקה, 96 גם עגול התחתון ולחזור על תהליך זה עבור כל בארות מסומנות. לבסוף, למלא את בארות ריקות עם 200 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה.
הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר הצלחת הכפולה יש דגירה במשך 24 עד 48 שעות לשכפל אותו שוב על ידי הוספת 100 microliters של RPMI עם אנטיביוטיקה לכל באר. השתמשו בפיפיטה רב-ערוצית כדי לערבב בעדינות ולהעביר 100 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת חדשה עם 96 בארים.
שים אחת משתי הצלחות הכפולות האלה באינקובטור. השתמש השני של הלוחות הכפולים החדשים עבור cytometry זרימה, על ידי הוספת תחילה חמישה microliters של PMA / Ionomycin מאסטר לערבב ל הבאר, כדי לעורר את התאים. דגירה במשך 24 שעות ולהכין את התאים עבור cytometry זרימה כמתואר בטקסט.
שער כל תא יחיד קיימא המבוסס על גודל פיזור קדימה וצד. לנתח ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי על ידי ציטומטריה זרימה. כדי להקרין שיבוטים חד-תאיים על-ידי PCR, עצבו פריימרים P5 ו- P6 להקרנת PCR בהתבסס על רצף הכתבים שנבחר, כדי להגביר 500 עד 800 זוגות בסיס של רצף הכתבים.
לשליטה חיובית ב-PCR, תכנן פריימרים P7 ו-P8 שמגבירים 630 זוגות בסיסים של לוקוס גנומי פראי ולא ממוקד. תכנן זוג פריימר שלישי המגבר 500 עד 600 זוגות בסיסים של עמוד השדרה של מיקוד וקטור כפקד לשילוב לא ספציפי של רצפי עמוד שדרה של מיקוד וקטור. לאחר השיבוטים בצלחת הכפולה השנייה גדלו מספיק, להכין אותם הקרנת PCR על ידי צנטריפוגה הראשונה את הצלחת במשך 10 דקות ב 300-G בטמפרטורת החדר.
בזהירות להוריד את supernatant, הקפדה לא להפריע את גלולת התא. לשטוף את התאים עם 100 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים, צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 300 G בטמפרטורת החדר. הסר את ה- PBS והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לכל באר.
פיפטה בעדינות לערבב, ולהעביר את ההשעיה לצלחת PCR חדשה. לאטום את הצלחת עם סרט פרפין דגירה במשך שעה אחת ב 55 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר. לאחר צנטריפוגה למטה פסולת התא במהירות המרבית במשך 10 דקות, להעביר את supernatant לצלחת PCR חדשה.
הוסף 10 microliters של תא זה lysate לכל באר של צלחת PCR 96-well מלא 110 microliters של H2O מזוקק, ל הבאר. ואז דגירה במשך 10 דקות ב 99 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר, כדי להשבית proteinase K.Use 2 microliters של תא זה ללקט כתבנית ולהשתמש בתערובת ראשית PCR מסחרית להקרנה, בקרה ו- PCR עמוד השדרה. הפעל PCR במשך 38 עד 40 מחזורים של הגברה PCR בפורמט 96 באר.
השתמש חמישה microliters של מוצרי PCR ולהפעיל אותם על 1.5% agarose TAE ג'ל לנתח ולשלב את ציטומטריית זרימה ותוצאות PCR, כדי לאשר שיבוטים תא יחיד. ביטוי גנים כתב לאחר אינדוקציה PMA / Ionomycin אושרה על ידי שני ציטומטריה זרימה PCR בארבעה עד 12% של תאים, בהתאם לאתר האינטגרציה. ניתוח PCR של דנ"א גנומי באמצעות פריימרים לצומת אינטגרציה של חמישה ראשים ושלושה ראשים, מאשרים כי אירועי מיקוד התרחשו.
לאחר ההקרנה של שיבוטים תא יחיד עבור מיקוד נכון על ידי cytometry זרימה, שיבוטים עם גבוה, נמוך ולא ביטוי גנים כתב פלואורסצנטי נצפו. שיבוטים תא יחיד אושרו גם על ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לכתב פריימרים שליטה. שיבוטים אישרו חיובי בהקרנת PCR הוצאו ונותחו עוד יותר עבור מיקוד נכון על ידי כתם דרומי, באמצעות בדיקה ספציפית לכתב ו מחייב בדיקה גנומי מחוץ לכתב.
רק חלק הראו גדלי הלהקה הנכונים בניתוח הכתמים הדרומיים ושלבו את הכתב בצורה הטרוזית, מה שמראה שחשוב לאמת את תוצאות PCR על ידי כתם דרומי. שיבוטים נותחו גם על ידי רצף כדי לאשר עוד יותר שיבוטים חד-תאיים חיוביים. רצף של אתר היעד: אלל הומולוגי, אם הכתב לא השתלב, חשף מוטציות הנגרמות על ידי Cas9.
לאחר השליטה, הדור של איידס כתב שורות ניתן להשיג בחודשיים עד שלושה חודשים. לפני הפילוח, חשוב להשקיע מספיק זמן בבחירת אתר אינטגרציה אצל כתב מתאים, בהתאם לשאלת המחקר שאתה רוצה להתמודד איתה. כתבים יכולים למשל, לכלול אלמנטים רגולטוריים שונים HIV אם תרצה.
בעקבות הליך זה, קווי תאים יכולים לשמש לדוגמה כדי לבדוק את ההשפעה של סוכנים עולים השהיה שונים על פעילות שעתוק של הכתב LTR, בהתאם לאתר האינטגרציה שלה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור אינטגרציה-אתר ספציפי HIV כתב קווים לעיצוב מדריך RNAs ומיקוד וקטור, ביצוע הנדסת גנום מבוסס CRISPR /Cas9 בתאי jurkat, הפקת שיבוטים תא יחיד ובחירה שיבוטים ממוקדים כראוי על ידי FACS ו PCR הקרנה. אל תשכח, שאם תבחר לעבוד עם כתב HIV מוסמך שכפול, אתה צריך לעבוד תחת תנאי בטיחות BSL3.
