يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الاختيار المسبق من استنساخ الكروموسومات من قبل سلالات Pichia pastoris التعبير عن البروتينات المؤتلفة في ظل ظروف دي مكبوتة من قبل زراعة قارورة هزة بسيطة قبل التوسع. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن مستوى عال من الميثانول التعبير عن البروتين الحر يمكن تحقيقه باستخدام Pichia pastoris، الذي يدعمه الرصد الدقيق على الانترنت من المعلمات زراعة هامة. عموما، قد الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال لأن النقطة الزمنية لبدء زراعة الزجاج تغذية يجب أن تتكيف مع خصائص النمو من سلالة الإنتاج محددة.
قبل إعداد الثقافة الرئيسية، بذور مستعمرة واحدة جديدة من سلالة التعبير من الاهتمام في 5 مل من الخميرة بيبتو ومرق ديكستروز في أنبوب مخروطي 50 مل. اترك الغطاء مفتوحًا قليلاً للسماح بالتهيّم المناسب. من، وضع الثقافة في شاكر في 28 درجة مئوية، 80٪ الرطوبة و 100 إلى 130 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
في صباح اليوم التالي بدء البرنامج لربط الأجهزة عبر البلوتوث. بعد ذلك، اضغط على الزر الفضي الموجود في مقدمة جهاز قياس الكتلة الحيوية لتشغيل اتصال Bluetooth بالجهاز وانقر فوق العثور على الأجهزة في برنامج مراقبة الكمبيوتر. اسحب وإفلات الأجهزة التي تم العثور عليها إلى المربعات في درج القياس وانقر فوق الاتصال.
عند إجراء اتصال ناجح، ستظهر شاشة تحكم. لإعداد تجربة، انقر فوق بدء القياس. قم بتسمية التجربة وتحقق من تمكين كافة المعلمات المطلوبة للمراقبة.
تعيين الفاصل الزمني إلى ثلاث دقائق ومتوسط نقاط القياس إلى 11. أدخل أسماء العينات وتخطي معايرة الزاوية. قياس كثافة الخلية من ثقافة بين عشية وضحاها المخفف في نسبة واحد إلى عشرين في المتوسطة في زراعة في مقياس الطيفي في طول موجة نانومتر 600.
تلقيح 50 مل من المتوسط مع ثقافة بين عشية وضحاها إلى OD 600 من 05. من، ضع القارورة في أجهزة الكشف عند 28 درجة مئوية، 130 دورة في الدقيقة و80٪ الرطوبة لمدة خمس دقائق. انقر فوق بدء القياس في البرنامج.
بعد أربع ساعات من التطعيم، استخدم عينة 2 مل لقياس كثافة الخلايا كما هو موضح للتو. عندما يقترب تركيز الأكسجين الصفر والخلايا هي على مرحلة النمو الأسي إضافة أربعة أقراص تغذية الجلسرين إلى كل قارورة تحت ظروف معقمة. من، إعادة القارورة إلى حاضنة اهتزاز لمدة 60 إلى 90 ساعة إضافية.
أخذ عينات كل 24 ساعة لمراقبة كثافة الخلية والتعبير البروتين من قبل مقايسة الاختيار. في نهاية الزراعة، ونقل الثقافات إلى أنابيب مخروطية 50 مل للطرد المركزي. قم بتصدير بيانات القياس عبر الإنترنت كملف جدول بيانات من البرنامج لمزيد من التحليل.
في هذه الزراعة ممثل، وكان تركيز الجلسرين بدءا 5٪، على الرغم من أن تمت إضافة الأقراص تغذية عندما كانت الكتلة الحيوية زيادة مضاعفة، انخفض الأكسجين إلى ما يقرب من الصفر. انخفاض تركيزات الجلسرين خفض تأثير قيود الأكسجين على المدى القصير، وبالتالي يوصى لتكتيلات البروتين إزالة المكبوتة. في هذه التجربة التمثيلية التي تم التعبير عن هرمون النمو البشري تحت سيطرة مصدر الكربون المروج المكبوتة على استنفاد الجلسرين تم ضمان التعبير البروتين عن طريق إزالة القمع بإضافة أربعة أقراص تغذية لكل قارورة.
كما هو متوقع من هرمون النمو البشري التعبير وتطور الكتلة الحيوية زادت مع مرور الوقت في وجود أقراص تغذية الجلسرين, في حين انخفض التعبير البروتين مع مرور الوقت وظلت الكتلة الحيوية ثابتة في غياب الملحق الجلسرين. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن نلاحظ بعناية المعلمات زراعة لتحديد التعبير الأمثل وقت البدء. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحديد البروتين تركيز الغربية لطخة تحليل أو تحليل النشاط لتقييم غلة البروتين وكذلك تجارب صغيرة على نطاق واسع bioreactor للإجابة على أسئلة إضافية حول أداء سلالة الفردية على نطاق أوسع.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التعبير البروتيني المؤتلف الحر للميثانول لاستكشاف بديل واعد للميثانول الميثانول المعتمد على الميثانول AOX1 على Pichia pastoris.
