Bu yöntem, pichia pastoris suşları tarafından kromozomklonlarının ön seçiminde basit bir sallama şişesi ekimi ile bastırılmış koşullar altında rekombinant proteinleri ifade yardımcı olabilir ölçekleme önce. Bu tekniğin en büyük avantajı, önemli yetiştirme parametrelerinin tam online izlenmesi ile desteklenen Pichia pastoris kullanılarak yüksek düzeyde metanolsüz protein ekspresyonuna ulaşılabiliyor olmasıdır. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, cam yetiştirme yemi başlatma nın zaman noktasının belirli üretim geriliminin büyüme özelliklerine uyarlanması gerektiği için mücadele edebilirler.
Ana kültürü kurmadan önce, 50 ml konik bir tüp te maya pepto ve dekstroz suyu 5 ml içine ilgi ifade gerginlik tek bir taze koloni tohum. Uygun havalandırma sağlamak için kapağı biraz açık bırakın. Than, 28 santigrat derece, % 80 nem ve 100-130 RPM gecede bir shaker kültür yerleştirin.
Ertesi sabah Bluetooth üzerinden cihazları bağlamak için yazılım başlatın. Ardından, cihaza bluetooth bağlantısını açmak için biyokütle ölçüm cihazının önündeki gümüş düğmeye basın ve bilgisayar izleme yazılımındaki cihazları bul'a tıklayın. Bulunan aygıtları ölçü tepsisindeki karelere sürükleyin ve bırakın ve bağlan'ı tıklatın.
Başarılı bir bağlantı yapıldığında, bir denetim ekranı görüntülenir. Deneme ayarlamak için, başlangıç ölçümü'nü tıklatın. Denemeyi adlandırın ve izleme için gereken tüm parametrelerin etkin olup olmadığını kontrol edin.
Aralığı üç dakikaya, ortalama ölçüm puanını 11'e ayarlayın. Örneklerin adlarını girin ve açı kalibrasyonundan atlayın. 600 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometrede bir ila yirmi oranında seyreltilmiş gece kültürünün hücre yoğunluğunu ölçün.
05 bir OD 600 gece kültürü ile orta 50 ml aşılamak. Daha, beş dakika boyunca 28 santigrat derece, 130 RPM ve% 80 nem de dedektörleri şişeleri yerleştirin. Yazılımda başlangıç ölçümü'nü tıklatın.
Aşılamadan dört saat sonra, hücre yoğunluğu ölçümü için sadece gösterildiği gibi 2 ml'lik bir numune kullanın. Oksijen konsantrasyonu sıfıra yaklaşırken ve hücreler üstel büyüme aşamasında steril koşullar altında her şişe için dört gliserol besleme diskleri ekleyin. Daha fazla, ek bir 60 ila 90 saat için sallayarak kuluçka için şişeleri geri dönün.
Hücre yoğunluğunu ve protein ekspresyonunu seçerek izlemek için her 24 saatte bir numune alın. Ekimin sonunda, santrifüj için 50 ml konik tüpler içine kültürleri aktarın. Daha fazla analiz için çevrimiçi ölçüm verilerini yazılımdan elektronik tablo dosyası olarak dışa aktarın.
Bu temsili ekimde, başlangıç gliserol konsantrasyonu oldu 5%Biyokütle katlanarak artarken yem diskleri eklendi rağmen, oksijen neredeyse sıfıra düştü. Düşük gliserol konsantrasyonları kısa süreli oksijen sınırlamaları etkisini azalttı ve bu nedenle de-bastırılmış protein ekspresyonu için tavsiye edilir. Gliserol tükenmesi üzerine bastırılmış bir karbon kaynağının kontrolü altında insan büyüme hormonunun ifade edildiği bu temsili deneyde, şişe başına dört yem diski eklenmesiyle protein ekspresyonu sağlanmıştır.
Beklendiği gibi insan büyüme hormonu ekspresyonu ve biyokütle gelişimi gliserol yem disklerinin varlığında zaman içinde arttı, protein ekspresyonu zamanla azaldı ve biyokütle gliserol takviyesi yokluğunda sabit kaldı. Bu yordamı çalışırken, en iyi ifade başlangıç saatini belirlemek için yetiştirme parametrelerini dikkatle gözlemleyip hatırlamayı unutmayın. Bu prosedürütaki protein konsantrasyonu tayini batı leke analizi veya aktivite tahlilleri gibi diğer yöntemler protein verimi değerlendirmesi için yanı sıra küçük ölçekli biyoreaktör deneyleri daha büyük bir ölçekte bireysel zorlanma performansı hakkında ek sorulara cevap için yapılabilir.
Geliştirilmesinden sonra, bu teknik pichia pastoris yaygın olarak kullanılan metanol bağımlı AOX1 organizatörü için umut verici bir alternatif keşfetmek için metanol serbest rekombinant protein ekspresyonu alanında araştırmacılar için yol açtı.
