이 방법은 확장하기 전에 간단한 쉐이크 플라스크 재배에 의해 억압 된 조건하에서 재조합 단백질을 표현하는 피치아 목회균에 의한 염색체 클론의 사전 선택에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 중요한 재배 매개 변수의 정확한 온라인 모니터링에 의해 지원되는 피치아 목회를 사용하여 높은 수준의 메탄올 자유 단백질 발현을 달성 할 수 있다는 것입니다. 일반적으로, 이 방법에 새로 온 개인은 유리 성장 사료를 시작하기 위한 시점이 특정 생산 균주의 성장 특성에 적응되어야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있다.
주요 문화를 설정하기 전에 50ml 원문 튜브에 효모 펩토와 덱스트로스 국물의 5ml에 관심있는 표현 변형의 하나의 신선한 식민지를 시드. 뚜껑을 약간 열어 적절한 식기를 허용합니다. 보다, 28 섭씨, 80%의 습도와 100 ~130 RPM 하룻밤에 셰이커에 문화를 배치합니다.
다음날 아침 블루투스를 통해 장치를 연결하는 소프트웨어를 시작합니다. 다음으로 바이오매스 측정 장치 앞의 실버 버튼을 눌러 장치에 대한 Bluetooth 연결을 켜고 컴퓨터 모니터링 소프트웨어에서 장치를 찾습니다. 찾은 장치를 측정 트레이의 사각형에 드래그앤드롭하고 연결을 클릭합니다.
성공적인 연결이 이루어지면 컨트롤 화면이 나타납니다. 실험을 설정하려면 측정을 시작합니다. 실험이름을 지정하고 모니터링에 필요한 모든 매개 변수가 활성화되어 있는지 확인합니다.
간격을 3분으로 설정하고 평균 측정 포인트를 11로 설정합니다. 샘플이름을 입력하고 각도 보정을 건너뜁니다. 600 나노미터 파장에서 분광계에서 재배 배지에서 1~20비율로 희석된 야간 배양의 세포 밀도를 측정한다.
1박 배양으로 배지 50ml를 접종하여 05의 OD 600에 접종하였다. 보다, 28 섭씨, 130 RPM 및 80%의 습도에서 검출기에 플라스크를 5분 동안 놓습니다. 소프트웨어에서 측정을 시작하려면 클릭합니다.
접종 후 4시간 후, 방금 입증된 바와 같이 세포 밀도 측정을 위해 2ml 샘플을 사용하십시오. 산소 농도가 0에 가까워지고 세포가 기하급수적인 성장 단계에 있을 때 멸균 조건하에서 각 플라스크에 4개의 글리세롤 피드 디스크를 추가합니다. 보다, 추가 60 ~ 90 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다.
24시간마다 샘플을 채취하여 셀 밀도와 단백질 발현을 분석하여 선택분석으로 모니터링합니다. 재배가 끝나면 배양을 원심분리를 위해 50ml 원전 튜브로 옮긴다. 추가 분석을 위해 소프트웨어에서 온라인 측정 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다.
이 대표적인 재배에서, 시작 글리세롤 농도는 5%였지만 바이오매스가 기하급수적으로 증가할 때 사료 디스크가 추가되었지만 산소는 거의 0으로 감소하였다. 낮은 글리세롤 농도는 단기 산소 제한의 효과를 감소시키고 따라서 억압 된 단백질 발현에 권장됩니다. 이 대표적인 실험에서 인간 성장 호르몬이 글리세롤 고갈시 탄소원 억제 프로모터의 통제하에 발현된 대표적인 실험에서 플라스크당 4개의 사료 디스크를 첨가하여 억제에 의한 단백질 발현을 보장하였다.
예상대로 인간 성장 호르몬 발현 및 바이오매스 개발은 글리세롤 사료 디스크의 존재에서 시간이 지남에 따라 증가, 단백질 발현시간이 지남에 따라 감소하고 바이오 매스는 글리세롤 보충의 부재에 일정하게 유지하면서. 이 절차를 시도하는 동안 재배 매개 변수를 주의 깊게 관찰하여 최적의 식 시작 시간을 결정하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 단백질 농도 결정 서양 얼룩 분석 또는 활성 분석과 같은 다른 방법은 단백질 수율 평가뿐만 아니라 소규모 바이오 반응기 실험을 위해 수행될 수 있으며, 더 큰 규모의 개별 변형의 성능에 대한 추가 질문에 답할 수 있다.
개발 후, 이 기술은 피치아 목회에서 일반적으로 사용되는 메탄올 의존 AOX1 프로모터에 대한 유망한 대안을 탐구하기 위해 메탄올 무료 재조합 단백질 발현 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.
