Este método pode ajudar na pré-seleção de clones de cromossomos por pichia pastoris cepas expressando proteínas recombinantes sob condições desprimidas por um simples shake flask cultivos antes de escalar. A principal vantagem dessa técnica é que a expressão proteica livre de metanol de alto nível pode ser alcançada usando Pichia pastoris, que é apoiada pelo monitoramento on-line exato de importantes parâmetros de cultivo. Geralmente, indivíduos novos nesse método podem lutar porque o ponto de tempo para iniciar a alimentação de cultivo de vidro tem que ser adaptado às características de crescimento da cepa de produção específica.
Antes de montar a cultura principal, semeou uma única colônia fresca da expressão de interesse em 5 ml de pepto de levedura e caldo de dextrose em um tubo cônico de 50 ml. Deixe a tampa ligeiramente aberta para permitir a aeração adequada. Do que, coloque a cultura em um shaker a 28 graus Celsius, 80% de umidade e 100 a 130 RPM durante a noite.
Na manhã seguinte, inicie o software para conectar os dispositivos via Bluetooth. Em seguida, pressione o botão prata na parte frontal do dispositivo de medição de biomassa para ligar a conexão Bluetooth ao dispositivo e clicar em encontrar dispositivos no software de monitoramento do computador. Arraste e solte os dispositivos encontrados para os quadrados na bandeja de medição e clique em conectar.
Quando uma conexão bem sucedida é feita, uma tela de controle aparecerá. Para configurar um experimento, clique na medição de início. Nomeie o experimento e verifique se todos os parâmetros necessários para o monitoramento estão ativados.
Defina o intervalo para três minutos e a média de medição aponta para 11. Digite os nomes das amostras e pule a calibração do ângulo. Meça a densidade celular da cultura overnight diluída em uma proporção de um a vinte em meio de cultivo em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 600 nanômetros.
Inocular 50 ml do meio com a cultura da noite para o dia para um OD 600 de 05. Do que, coloque os frascos nos detectores a 28 graus Celsius, 130 RPM e 80% de umidade por cinco minutos. Clique na medição iniciar no software.
Quatro horas após a inoculação, use uma amostra de 2 ml para medição da densidade celular como apenas demonstrado. Quando a concentração de oxigênio está se aproximando de zero e as células estão na fase de crescimento exponencial adicione quatro discos de alimentação de glicerol a cada frasco sob condições estéreis. Do que, devolva os frascos à incubadora por mais 60 a 90 horas.
Pegue amostras a cada 24 horas para monitorar a densidade celular e a expressão proteica pelo ensaio de escolha. Ao final do cultivo, transfira as culturas para tubos cônicos de 50 ml para centrifugação. Exporte os dados de medição on-line como um arquivo de planilha do software para análise suplementar.
Neste cultivo representativo, a concentração inicial de glicerol foi de 5% Embora os discos de alimentação tenham sido adicionados quando a biomassa estava aumentando exponencialmente, o oxigênio diminuiu para quase zero. Concentrações de glicerol mais baixas reduziram o efeito das limitações de oxigênio a curto prazo e, portanto, são recomendadas para a expressão proteica desprimida. Neste experimento representativo em que o hormônio do crescimento humano foi expresso sob o controle de um promotor de fonte de carbono reprimido após o esgotamento do glicerol, a expressão proteica por despressão foi assegurada pela adição de quatro discos de alimentação por frasco.
Como esperado, a expressão hormonal de crescimento humano e o desenvolvimento da biomassa aumentaram ao longo do tempo na presença dos discos de alimentação de glicerol, enquanto a expressão proteica diminuiu ao longo do tempo e a biomassa permaneceu constante na ausência do suplemento de glicerol. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de observar cuidadosamente os parâmetros de cultivo para determinar um tempo de início de expressão ideal. Após este procedimento, outros métodos como a determinação da concentração de proteínas ou ensaios de atividade podem ser realizados para avaliação de rendimento de proteínas, bem como experimentos bioreatores de pequena escala para responder a perguntas adicionais sobre o desempenho da cepa individual em uma escala maior.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da expressão proteica recombinante livre de metanol explorarem uma alternativa promissora ao promotor aoX1 dependente de metanol comumente usado em Pichia pastoris.
