Questo metodo può aiutare nella preselezione dei cloni cromosomici da parte dei ceppi di Pichia pastoris che esprimono proteine ricombinanti in condizioni derepresse da una semplice coltivazione di fiasche di frullato prima di aumentare il ridimensionamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'espressione proteica libera da metanolo di alto livello può essere ottenuta utilizzando Pichia pastoris, che è supportata dall'esatto monitoraggio online di importanti parametri di coltivazione. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo possono avere difficoltà perché il punto di tempo per l'avvio del mangime per la coltivazione del vetro deve essere adattato alle caratteristiche di crescita dello specifico ceppo di produzione.
Prima di impostare la coltura principale, seminare una singola colonia fresca del ceppo di espressione di interesse in 5 ml di pepto di lievito e brodo di destrosio in un tubo conico da 50 ml. Lasciare il coperchio leggermente aperto per consentire una corretta aerazione. Inoltre, metti la coltura in uno shaker a 28 gradi Celsius, umidità dell'80% e da 100 a 130 giri/min durante la notte.
La mattina dopo avviare il software per collegare i dispositivi tramite Bluetooth. Quindi, premere il pulsante silver sulla parte anteriore del dispositivo di misurazione della biomassa per attivare la connessione Bluetooth al dispositivo e fare clic su trova dispositivi nel software di monitoraggio del computer. Trascinare e rilasciare i dispositivi trovati nei quadrati della linea di misura e fare clic su connetti.
Quando viene effettuata una connessione riuscita, verrà visualizzata una schermata di controllo. Per impostare un esperimento, fare clic su Avvia misurazione. Assegnare un nome all'esperimento e verificare se tutti i parametri necessari per il monitoraggio sono abilitati.
Impostare l'intervallo su tre minuti e i punti di misurazione medi su 11. Immettere i nomi dei campioni e saltare la calibrazione dell'angolo. Misurare la densità cellulare della coltura notturna diluita ad un rapporto da uno a venti nel mezzo di coltivazione in uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 600 nanometri.
Inoculare 50 ml del mezzo con la coltura notturna ad un OD 600 di 05. Inoltre, posizionare i contenitori nei rivelatori a 28 gradi Celsius, 130 RPM e 80% di umidità per cinque minuti. Fare clic su Avvia misurazione nel software.
Quattro ore dopo l'inoculazione, utilizzare un campione da 2 ml per la misurazione della densità cellulare, come appena dimostrato. Quando la concentrazione di ossigeno si avvicina allo zero e le cellule sono in fase di crescita esponenziale aggiungere quattro dischi di alimentazione del glicerolo a ciascun pallone in condizioni sterili. Che, restituire i contenitori all'incubatrice di scuotimento per altre 60-90 ore.
Prelevare campioni ogni 24 ore per monitorare la densità cellulare e l'espressione proteica per il saggio di scelta. Al termine della coltivazione, trasferire le colture in tubi conici da 50 ml per la centrifugazione. Esportare i dati di misurazione online come file di foglio di calcolo dal software per ulteriori analisi.
In questa coltivazione rappresentativa, la concentrazione di glicerolo iniziale era del 5%Sebbene i dischi di alimentazione fossero stati aggiunti quando la biomassa stava aumentando esponenzialmente, l'ossigeno è sceso a quasi zero. Concentrazioni più basse di glicerolo hanno ridotto l'effetto dei limiti di ossigeno a breve termine e sono quindi raccomandate per l'espressione proteica derepressa. In questo esperimento rappresentativo in cui l'ormone della crescita umano è stato espresso sotto il controllo di un promotore represso della fonte di carbonio al momento dell'esaurimento del glicerolo, l'espressione proteica mediante depressione è stata assicurata dall'aggiunta di quattro dischi di alimentazione per pallone.
Come previsto l'espressione dell'ormone della crescita umano e lo sviluppo della biomassa è aumentato nel tempo in presenza dei dischi di alimentazione del glicerolo, mentre l'espressione proteica è diminuita nel tempo e la biomassa è rimasta costante in assenza del supplemento di glicerolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di osservare attentamente i parametri di coltivazione per determinare un'ora di inizio dell'espressione ottimale. Seguendo questa procedura, altri metodi come la determinazione della concentrazione proteica l'analisi western della macchia o i test di attività possono essere eseguiti per la valutazione della resa proteica e esperimenti di bioreattore su piccola scala per rispondere a domande aggiuntive sulle prestazioni del singolo ceppo su scala più ampia.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'espressione proteica ricombinante libera da metanolo per esplorare una promettente alternativa al promotore AOX1 dipendente dal metanolo comunemente usato su Pichia pastoris.
