メタノール・組成分析解消抑圧技術の採用によって独立式

この方法は、ピキア牧歌によってクローン染色体の事前選択を助けることができるピキア牧歌株は、スケールアップ前に単純なシェイクフラスコ培養によって抑圧されていない条件下で組換えタンパク質を発現する。この技術の主な利点は、重要な栽培パラメータの正確なオンラインモニタリングによってサポートされているピキアパストリスを使用して、高レベルのメタノールフリータンパク質発現を達成できることです。一般的に、この方法に新しい個人は、特定の生産株の成長特性に合わせてガラス成長飼料を開始するためのタイムポイントを必要とするため、苦労する可能性があります。

主な培養を設定する前に、50 mlの円錐チューブで5mlの酵母ペプトおよびデキストロースブロスに目的の発現株の単一の新鮮なコロニーを播種する。適切な吸入を可能にするために蓋を少し開いたままにしておきます。より、一晩で摂氏28度、湿度80%、100〜130RPMでシェーカーに培養を入れます。

接続が成功すると、制御画面が表示されます。実験を設定するには、[測定開始]をクリックします。実験に名前を付け、監視に必要なすべてのパラメーターが有効になっているかどうかを確認します。

間隔を 3 分に設定し、平均測定ポイントを 11 に設定します。サンプルの名前を入力し、角度の調整をスキップします。分光光度計で600ナノメートルの波長で1~20分の1の割合で希釈した一晩培養物の細胞密度を測定する。

培地の50mlを一晩培養して05のOD600に接種する。は、フラスコを28°C、130 RPM、湿度80%の検出器に5分間置きます。ソフトウェアで測定開始をクリックします。

接種の4時間後、ちょうど実証したように細胞密度測定用に2mlサンプルを使用する。酸素濃度がゼロに近づき、細胞が指数成長期にあるとき、滅菌条件下で各フラスコに4つのグリセロール供給ディスクを追加します。より、フラスコを更に60〜90時間振る培養器に戻す。

24時間ごとにサンプルを採取し、選択したアッセイにより細胞密度とタンパク質発現を監視します。培養終了時に、培養物を50mlの円錐チューブに移して遠心分離を行う。さらに分析するために、ソフトウェアからオンライン測定データをスプレッドシートファイルとしてエクスポートします。

本代表的な栽培では、バイオマスが指数関数的に増加した際に原料となるグリセロール濃度が5%であったが、酸素はほぼゼロに減少した。低いグリセロール濃度は、短期的な酸素制限の効果を減少させ、したがって、抑圧を緩和したタンパク質発現に推奨される。この代表的な実験では、グリセロール枯渇時に抑制された促進剤を抑制した炭素源の制御下で発現したこの代表的な実験では、フラスコ当たり4つのフィードディスクを添加することにより、タンパク質発現を抑制して確認した。

予想通り、グリセロール供給ディスクの存在下でのヒト成長ホルモン発現とバイオマスの開発は時間の経過とともに増加し、一方で、グリセロールサプリメントがない場合にはタンパク質発現が減少し、バイオマスは一定のままでした。この手順を試みる際には、最適な発現開始時間を決定するために、栽培パラメータを注意深く観察することが重要です。この手順に従って、タンパク質濃度判定ウェスタンブロット分析や活性アッセイなどの他の方法は、タンパク質収率評価および小規模バイオリアクター実験のために、個々の株の性能に関する追加の質問に大きなスケールで答えるために行うことができる。

その開発後、この技術は、メタノールフリー組換えタンパク質発現の分野の研究者が、ピキア牧歌に一般的に使用されるメタノール依存性AOX1プロモーターに代わる有望な代替手段を探求する道を開いた。