ويمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن السالمونيلا من عينات الطعام وتحديد الممرض إلى مستوى السلالة من خلال البصمات الجينية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يجمع بين اكتشاف السالمونيلا و subtyping في سير عمل واحد ويقصر بشكل كبير الوقت من تحول عينة الطعام الملوثة السالمونيلا لبصمات أصابع الممرض. للبدء، ضع بشكل مُهكَم عينة 25 غرامًا من الطعام داخل كيس خلاط مختبر معقمة مع فلتر مدمج أو أعد مسحة بيئية اختياريًا عن طريق ترطيب اسفنجة مع مرق الإثراء، وسحبها عبر سطح محدد مسبقًا ووضعها داخل كيس الخلاط.
باستخدام خلاط مختبر، اخلط كل عينة بدقة مع 225 ملليلتر من مرق إثراء RV. ثم احتضان الخليط في 42 درجة مئوية لمدة أربع إلى 21 ساعة. بعد ذلك، جمع 50 ملليلتر subsample من مرق إثراء من الجانب تمت تصفيتها من الحقيبة.
ثم الطرد المركزي على سبيل المثال الفرعي في 100 مرة ز لمدة 10 دقائق. نقل بعناية فائقة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر الطرد المركزي والطرد المركزي في 3،000 إلى 6،000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تجاهل عظمى وغسل بيليه في خمسة ملليلتر من BPW.
Resuspend بيليه في خمسة ملليلتر من BPW. أولاً، ذاب المخزن المؤقت العينة ومخزن التفاعل من عدة MDA على الجليد. ضع ملليلتر واحد من الخلايا التي يتم تعليقها في BPW و 20 ميكرولترات من الخرز المضاد لسالمونيلا في أنبوب microcentrifuge.
ضع أنبوب microcentrifuge على خلاط دوار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة ثلاث دقائق. عكس رف المغناطيسي عدة مرات لتركيز الخرز في بيليه.
الحفاظ على أنبوب على رف المغناطيسي، وpirate وتجاهل ناضح. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من مخزن الغسيل إلى الأنبوب. إزالة حامل أنبوب من الرف وعكس حامل أنبوب عدة مرات لإزالة أي بكتيريا غير ملزمة خصيصا من المجمع.
بعد الغسيل الثالث ، يُشعّر المُنطَع من الأنبوب ويتخلص منه. ثم إزالة أنبوب من الرف المغناطيسي والطرد المركزي لثانية واحدة. ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق قبل إزالة أي عازلة الغسيل المتبقية.
Resuspend المجمعات السالمونيلا حبة في تسعة ميكرولترات من عينة العازلة واحتضان الأنبوب في 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد تبريد المجمعات على الجليد، إضافة تسعة ميكرولترات من العازلة رد فعل وميكر واحد من مزيج انزيم. احتضان الأنبوب في دورة حرارية وفقا لبروتوكول النص وتبريد الأنبوب على الجليد.
بعد ذلك، استخدم جهاز الفلوروسم وبيكترومتر لقياس تركيز الحمض النووي ونقاء العينة. تخزين المنتجات النهائية في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية للتجارب المستقبلية. إعداد 18 ميكرولترات من خليط PCR لكل عينة وفقا لبروتوكول النص.
ثم اخلطي منتج MDA عن طريق الخفقان بلطف لأعلى ولون. إضافة اثنين microliters من تعليق المنتج MDA إلى خليط PCR. باستخدام بروتوكول PCR في الوقت الحقيقي الأمثل، قم بتشغيل PCR في الوقت الحقيقي وفقًا لبروتوكول النص.
إضافة حلول العازلة والكواشف إلى المنتج MDA كما هو محدد في بروتوكول النص ونقل الناتجة 40 microliters من المنتج MDA تسلسل تستعد إلى لوحة جديدة وإضافة 20 ميكرولترات من الخرز تنقية PCR إلى كل بئر. بعد ذلك، احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ثم غسل الخرز مع 80٪ الإيثانول وتجفيفها لمدة 12 دقيقة.
Resuspend الخرز المجفف في 53 ميكرولترات من العازلة resuspension واحتضان الخرز لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. وأخيرا، تمييع والمكتبات تجمع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وفي هذا البروتوكول، تم إجراء تقييم كمية مستهدفة للحمض النووي السالمونيلا بواسطة PCR في الوقت الحقيقي.
وتراوحت النتائج التمثيلية لعلامتين من صدور الدجاج الملوثة بالسلمونيلا بين 701.54 إلى 945.86 نانوغرام لكل ميكرولتر مما يشير إلى أن عينة الحمض النووي تم تضخيمها بشكل فعال. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن يغسل والتعامل مع الخرز IMS بعناية، والحفاظ على الكواشف MDA والمنتجات خالية من الملوثات والحفاظ على غطاء محرك السيارة نظيفة. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سلامة الأغذية والصحة العامة لاستكشاف التتبع السريع والعالي الدقة لملوثات السالمونيلا في عينات الأغذية وبيئات المنتجات وسلاسل التوريد.
لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية يمكن أن يكون خطيرا للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية واتباع الممارسات المختبرية الجيدة عند تنفيذ هذا الإجراء.
