음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 준 metagenomic 분석

이 방법은 음식 견본에서 살모넬라를 검출하고 유전 지문링을 통해 긴장 수준에 병원체를 확인하는 데 이용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살모넬라 검출과 하위 입력을 단일 워크플로우로 결합하고 살모넬라 오염 식품 샘플에서 병원균의 지문까지 소요 시간을 실질적으로 단축한다는 것입니다. 우선, 멸균 실험실 블렌더 백 에 25그램의 식품 샘플을 내장 필터로 배치하거나 스폰지를 농축 국물로 무균적으로 적시적으로 적시화하여 환경 면봉을 준비하여 미리 결정된 표면을 가로질러 드래그하여 블렌더 백 안에 넣습니다.

실험실 블렌더를 사용하여 각 샘플을 RV 농축 국물 225 밀리리터와 철저히 혼합합니다. 그런 다음 4 ~21 시간 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 배양합니다. 그 후, 가방의 여과된 측면에서 농축 국물의 50 밀리리터 서브샘플을 수집합니다.

그런 다음 10 분 동안 100 배 g에서 하위 샘플을 원심 분리합니다. 10분 동안 3, 000에서 6, 000배 g의 새로운 50밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기로 상피체를 조심스럽게 옮긴다. 상체를 버리고 BPW의 5 밀리리터로 펠릿을 씻으십시오.

BPW의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 먼저, 얼음 위에 있는 MDA 키트로부터 샘플 버퍼 및 반응 버퍼를 해동한다. BPW에 재중단 된 세포의 1 밀리리터와 마이크로 센트리슈후지 튜브에 항 살모넬라 구슬 20 마이크로 리터를 놓습니다.

마이크로센트심분리기 튜브를 회전 믹서에 실온에서 30분 간 배치합니다. 그 후, 3 분 동안 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 마그네틱 랙을 여러 번 반전하여 구슬을 펠릿에 농축합니다.

튜브를 자기 랙에 고정하고, 흡인하고, 상퍼를 폐기하십시오. 다음으로 튜브에 1 밀리리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 랙에서 튜브 홀더를 제거하고 튜브 홀더를 여러 번 반전하여 복합체에서 비특이적 결합박테리아를 제거합니다.

세 번째 세척 후, 튜브에서 슈퍼 네티퍼를 흡인하고 폐기하십시오. 그런 다음 자기 랙에서 튜브를 제거하고 원심 분리기를 1 초 동안 제거합니다. 그런 다음 잔류 세척 버퍼를 제거하기 전에 3 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.

비드 살모넬라 복합체를 9마이크로리터의 샘플 버퍼로 재중단하고 3분 동안 95도의 튜브를 배양합니다. 얼음에 복합체를 냉각 한 후, 반응 버퍼의 9 마이크로 리터와 효소 믹스의 하나의 마이크로 리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 열 사이클러에서 튜브를 배양하고 얼음에 튜브를 냉각.

다음으로, 불소 스펙트로미터 계측기를 사용하여 샘플의 DNA 농도 및 순도를 측정합니다. 최종 제품을 음수 20°C에 저장하여 향후 실험을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플당 18마이크로리터의 PCR 혼합물을 준비합니다.

그런 다음 MDA 제품을 위아래로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. PCR 혼합물에 MDA 제품 서스펜션의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 최적화된 실시간 PCR 프로토콜을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 실행합니다.

텍스트 프로토콜에 명시된 대로 MDA 제품에 버퍼 솔루션 및 시약을 추가하고 시퀀싱 준비 MDA 제품의 결과 40 마이크로리터를 새 플레이트에 전송하고 각 웰에 PCR 정화 구슬 20 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 10 분 동안 실온에서 접시를 배양. 그런 다음 구슬을 80% 에탄올로 씻고 12분간 건조시다.

말린 구슬을 53마이크로리터의 재서스펜션 버퍼로 재중단하고 실온에서 2분 동안 구슬을 배양한다. 마지막으로 제조업체의 지침에 따라 라이브러리를 희석하고 풀로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 살모넬라 DNA의 표적 수량 평가는 실시간 PCR에 의해 수행되었다.

살모넬라 오염 된 닭 가슴살의 두 브랜드의 대표적인 결과는 샘플 DNA가 효과적으로 증폭되었음을 나타내는 마이크로리터 당 701.54에서 945.86 나노 그램범위. 이 절차를 시도하는 동안 IMS 구슬을 조심스럽게 씻고 처리하고 MDA 시약 및 제품을 오염 물질로부터 제거하고 깨끗한 후드를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 식품 안전 및 공중 보건 분야의 연구원들이 식품 샘플, 제품 환경 및 공급망에서 살모넬라 오염 물질의 신속하고 고해상도 추적을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

식인성 병원균과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비를 착용하고 좋은 실험실 관행을 따르는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.