この方法は、食品サンプルからサルモネラ菌を検出し、遺伝的フィンガープリントを介して株レベルまで病原体を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、サルモネラ検出とサブタイピングを単一のワークフローに組み合わせ、サルモネラ菌汚染食品サンプルから病原体の指紋までのターンアラウンドタイムを大幅に短縮することです。まず、無菌の実験室用ブレンダーバッグ内に25グラムの食品サンプルを作り込み、必要に応じて濃縮ブロスでスポンジを無菌で湿らせ、事前に決定された表面を横切って引きずり、ブレンダーバッグの中に入れて環境綿棒を準備します。
実験室用ブレンダーを使用して、各サンプルを225ミリリットルのRV濃縮液と十分に混合します。その後、42°Cで4〜21時間インキュベートします。この後、袋のろ過された側から濃縮液の50ミリリットルのサブサンプルを収集します。
次に、サブサンプルを100回gで10分間遠心する。慎重に10分間3,000〜6,000倍gで新しい50ミリリットル遠心管と遠心分離機に上清を移します。上清を捨て、BPWの5ミリリットルでペレットを洗います。
BPWの5ミリリットルでペレットを再懸濁します。まず、MDAキットから氷上でサンプルバッファーと反応バッファーを解凍します。BPWに再懸濁細胞1ミリリットル、マイクロ遠心チューブに抗サルモネラビーズ20マイクロリットルを入れる。
マイクロ遠心チューブを回転ミキサーに室温で30分間置きます。この後、3分間磁気スタンドにチューブを置きます。ビーズをペレットに濃縮するために、磁気ラックを数回反転します。
チューブを磁気ラックに保管し、吸引し、上清を捨てます。次に、チューブに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。チューブホルダーをラックから取り出し、チューブホルダーを数回反転して、非特異的に結合した細菌を複合体から取り除きます。
3回目の洗浄後、上清をチューブから吸引し、廃棄する。次に、マグネットラックからチューブを取り出し、1秒間遠心分離します。その後、残りの洗浄バッファーを取り外す前に、3分間磁気ラックにチューブを置きます。
9マイクロリットルのサンプルバッファーにビーズサルモネラ錯体を再中断し、チューブを摂氏95度で3分間インキュベートします。氷上で複合体を冷却した後、反応バッファーの9マイクロリットルと酵素ミックスの1マイクロリットルを追加します。テキストプロトコルに従ってサーマルサイクラーでチューブをインキュベートし、氷の上でチューブを冷却します。
次に、フルオロスペクトロメーターの器具を用いて、サンプルのDNA濃度と純度を測定します。最終製品は、将来の実験のためにマイナス20°Cで保存してください。テキストプロトコルに従って、サンプルごとに18マイクロリットルのPCR混合物を調製します。
その後、MDA製品を上下に軽くピペットで混ぜます。PCR混合物にMDA製品懸濁液の2マイクロリットルを加えます。最適化されたリアルタイム PCR プロトコルを使用して、テキスト プロトコルに従ってリアルタイム PCR を実行します。
テキストプロトコルで指定されたようにMDA製品にバッファー溶液および試薬を追加し、その結果40マイクロリットルのシーケンシング準備されたMDA製品を新しいプレートに移し、20マイクロリットルのPCR精製ビーズを各ウェルに加えます。次に、プレートを室温で10分間インキュベートする。その後、80%エタノールでビーズを洗浄し、12分間乾燥させます。
乾燥ビーズを再懸濁液バッファーの53マイクロリットルに再懸濁し、室温で2分間インキュベートします。最後に、メーカーの指示に従ってライブラリを希釈し、プールします。本プロトコルでは、サルモネラDNAの標的量評価をリアルタイムPCRにより行った。
サルモネラ菌汚染鶏胸肉の2つのブランドの代表的な結果は、サンプルDNAが効果的に増幅されたことを示すマイクロリットル当たり701.54から945.86ナノグラムの範囲であった。この手順を試みる間は、IMSビーズを慎重に洗浄および取り扱いし、MDA試薬および製品を汚染物質から解放し、清潔なフードを維持することを忘れないでください。開発後、この技術は、食品の安全性と公衆衛生の分野の研究者が、食品サンプル、製品環境およびサプライチェーンにおけるサルモネラ汚染物質の迅速かつ高解像度の追跡を探求する道を開いた。
食物媒介性病原体を使用することは非常に危険であり、個人的な保護具の着用や良い実験室の慣行に従うなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。
