هذا الإجراء يمكن أن تساعدنا على تحديد وظيفة الدائرة العصبية المحددة التي تشارك في تنظيم يقظة النوم مع التلاعب أقل الغازية ودقة زمنية عالية. هذه الطريقة تسمح لنا رصد سطح EEG في الوقت الحقيقي بالتزامن مع التلاعب في دائرة عصبية محددة لدراسة العلاقة السببية بين الدوائر والدول يقظة النوم. شوتا كوداني) سوف يُظهر الإجراء)
بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القارص، ضع مرهم على عيون الحيوان واستخدم قضبان الأذن ودبوس الأنف على الجهاز المجسم لتثبيت رأس الفأر المُصن على وسادة ماصة. عندما يتم إصلاح الرأس في الموقف، وجعل شق منتصف القوس في فروة الرأس للتأكد من أن التقاطع بين القوس sutura وssutura coronalis أو sutura lambdoidea هي في خط أفقي في نفس المستوى. لتجنب وجود فجوة في تحديد المواقع، اضبط قرصة الأنف وقضبان الأذن حسب الضرورة.
ثم استخدام المشابك سيرافين لعقد الجلد مفتوحة تطهير السطح المكشوفة من الجمجمة لتمكين الغرز القحفية أن تكون تصور أكثر وضوحا. وضخّن ناقل الفيروس المرتبط بأدينو، قم بتحميل حقنة من الإيثانول تم تعقيمها بـ 10 ملليلتر مع اثنين من ميكرولترات الزيت المعدني، يليها الحجم التجريبي للفيروس الذي سيتم حقنه. استخدام مضخة الحقن المجهري لضبط غيض من إبرة الحقن المجهري على bregma وملاحظة الإحداثيات كنقطة المنشأ.
ثم حرك الطرف إلى موقع الحقن المعين ووضع طرف الإبرة على الوضع. وضع علامة على الجمجمة في موقع الحقن واستخدام مثقاب أسنان مجهز بقاطع كربيد عيار 0.7 ملليمتر لحفر ثقب قطره حوالي 2 ملليمتر في الجمجمة. بعد إزالة الدم من حول الحفرة مع مسحة القطن، ببطء نقل الإبرة إلى نواة السرير من النتال أو BSNT وحقن ببطء حجم معين من حل الفيروس.
ثم اترك الإبرة في مكانها لمدة خمس دقائق للسماح للمحلول بالتسلل بشكل كافٍ إلى أنسجة BNST قبل سحب الإبرة بعناية. لكهربية الدماغ، أو تخطيط الدماغ، وكهربية كهربائية، أو EMG، زرع القطب الكهربائي، لحام أول اثنين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ التي تم تجريد ملليمتر واحد من العزل من كلا طرفي أقطاب EMG ووضع مركز الأقطاب الكهربائية على الـ bregma. ثم وضع علامة على موقف لكل قطب EEG.
لتحديد موضع زرع الألياف البصرية، قم بتوصيل ألياف بصرية إلى المتلاعب وتدوير ذراع المتلاعب بزاوية 30 درجة زائد أو ناقص مقابل خط أفقي. وضع تلميح الألياف على bregma وتسجيل الإحداثيات. حرك الطرف إلى خط الإدراج المستهدف ووضع علامة على الموضع على الجمجمة والموضع للبرلوى المرساة بجوار موقع الإدراج.
استخدام مثقاب الأسنان لحفر الجمجمة في كل موقع واستخدام المتلاعب لإدراج بلطف الألياف البصرية حتى تصل إلى أعلى BNST. وينبغي أن تستند الضراوة إلى اليورانيوم المتبقي. تأمين الألياف إلى الجمجمة مع المسمار مرساة، مع الحرص على عدم كسر دورا أو تلف أي أنسجة.
ثم تغطية الألياف والمسمار مع الصورة قابل للشفاء أسمنت الأسنان. بعد ذلك، حفر الثقوب لأقطاب EEG /EMG وإدراج غيض من القطب الأول في حفرة واحدة. عقد زرع بيد واحدة، وتطبيق مادة لاصقة سيانوكريات على المسافة بين الجمجمة والأقطاب الكهربائية وإدراج القطب بقية الطريق، مع الحرص على عدم تلف أي نسيج.
عندما تم وضع كل من الأقطاب الكهربائية، وتغطي محيط الأقطاب الكهربائية والألياف البصرية مع لاصقة سيانوكريلات إضافية وsyanoacrylate المسرّع لتجنب التسبب في أي انقطاع في النبير إلى كابلات بصرية وأقطاب الرصاص في المناطق التي تربط الأسلاك. الآن كشف عضلات الرقبة، وإدراج الأسلاك لأقطاب EMG تحت العضلات. ضبط طول القطب EMG بحيث تناسبها فقط تحت العضلات النوى وملء يزرع مع لاصقة أكثر سيانوكريلات والمسرع.
ثم ضع الماوس على وسادة الحرارة مع مراقبة حتى إعادة تعويض كامل. بالنسبة لمراقبة EEG/EMG أثناء الإثارة الضوئية للخلايا العصبية المستهدفة، استخدم أولاً عددية لضبط كثافة الليزر واستخدام الحماسة لربط طرف كابل الليزر بالألياف البصرية غير المستخدمة. تأكد من عدم وجود مساحة عند التقاطع بين الألياف والكابلات.
بعد 20 دقيقة، تنبعث الليزر الاحماء إلى مدقق كثافة وضبط كثافة إلى 10 مللي واط لكل ملليمتر مربع. تعيين مدة نبض الضوء إلى 10 مللي ثانية، وفترة الراحة إلى 40 مللي ثانية، والدورة إلى 20، والتكرار إلى 20. تغيير وضع الليزر إلى منطق الترانزستور والتأكد من أن تنبعث نبضات الضوء من الألياف التي تسيطر عليها منظم النمط.
قم بتوصيل القطب المزروع ومحول الكابل، ثم قم بتغطية الوصلة مع مواد غير قابلة للنفاذ لمنع تسرب الليزر. وعندما يكون الليزر جاهزًا، قم بنقل الفئران إلى الغرفة التجريبية لتسجيل EEG/EMG. لتقييم الكمون إلى اليقظة من حركة العين غير السريعة أو النوم السريع لحركة العين ، والحد من وقت التسجيل والموقع الأمثل كسب الوقت والسماح للفئران التحرك بحرية في غرفة تجريبية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
خلال الفترة التجريبية، مراقبة إشارات EEG و EMG في نفس شاشة التسجيل. تقييم حالة الماوس كاليقظة، النوم حركة العين غير السريع، أو سرعة حركة العين النوم باستخدام السيطرة على كسب كل موجة لسهولة التمييز بين كل دولة. لقياس حركة العين غير السريع النوم إلى زمن الاستجابة، لاحظ مستقرة غير السريع النوم حركة العين لمدة 40 ثانية، ثم بدوره على مولد نمط لتحفيز الصور وتأكيد انبعاثات الليزر إلى الألياف البصرية المزروعة.
ثم سجل إشارات EEG/EMG حتى تتغير حالة السكون إلى اليقظة. هنا تمثل آثار EEG / EMG قبل وبعد عرض تحفيز الصورة أثناء النوم حركة العين غير السريع. الجهد العالي وبطء التردد EEG مع عدم وجود إشارات EMG ، يمثل نوم حركة العين غير السريع.
أثار تحفيز الصور انتقالًا حادًا إلى اليقظة بعد ثانيتين تقريبًا من التحفيز في channelrhodopsin-2 الذي يعبر عن الفئران أثناء مراقبة الفئران لم تثبت هذا الانتقال ، مما يشير إلى أن إثارة الخلايا العصبية BNST GABA أثناء نوم حركة العين غير السريعة يؤدي إلى تحريض سريع من اليقظة. وعلى العكس من ذلك، لم يكن لتحفيز الصور أثناء النوم السريع لحركة العين أي تأثير لذلك ظهر تأثير انتقالي فقط في نوم حركة العين غير السريع. من المهم أن تأخذ الرعاية إلى التنسيق الدقيق لحقن الفيروس والخطوات زرع الألياف البصرية.
يمكن استخدام آثار EEG/EMG التي تم التقاطها أثناء تحليل النوم لتقييم عواقب التلاعب بالصور على الولايات اليقظة المختلفة في الفئران. هذه التقنية سوف تساعدنا أيضا تحديد المكونات والدوائر الأخرى المشاركة في تنظيم حالات يقظة النوم. استخدام نظارات واقية لتجنب تلف الليزر للعين وتأكد من التعقيم دائماً الحاويات ناقلات الفيروس المرتبطة adeno بعد الاستخدام.
