اختبار تآزر صفيف لوحة الداما اليدوي هو أسلوب كثيف العمالة وعرضة للخطأ. في المقابل، فإن أسلوب لوحة الداما التلقائية التي تعتمد على الطابعة النافثة للحبر يعمل على تحسين السرعة والدقة والإنتاجية بشكل كبير. طريقة الداما بورد الآلي يجعل من الممكن لفحص أعداد كبيرة من الأدوية لمجموعات التآزر، في حين أن طريقة الوقت قتل يمكن أن تؤكد ومواصلة استكشاف نشاط هذه المجموعات.
اكتشاف المضادات الحيوية الجديدة لا يواكب انتشار المقاومة، ولكن التحقيق في تركيبات التآزر يوفر إمكانية لإنقاذ الأدوية الموجودة لعلاج البكتيريا المقاومة. على الرغم من أننا نبرهن على هذه التقنية مع مضادات الجراثيم ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا مع فئات أخرى من مضادات الميكروبات أو حتى لأنواع مختلفة من اختبار الدواء أو المركب. في هذا الفيديو، نُظهر طريقة صفيف لوحة الداما الآلية وطريقة يدوية لقتل الوقت.
نقترح إجراء دراسات صفيف الداما أولاً لتحديد التركيبات الواعدة ، ثم التحقيق في هذه الدراسات الإضافية مع دراسات قتل الوقت. للبدء، وجعل حلول الأسهم المضادة للميكروبات من colistin و minocycline، ومن ثم تنفيذ مراقبة الجودة على حلول الأسهم كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. بعد ذلك، أضف حوالي ملليلتر واحد من كلوريد الصوديوم 0.9٪، ملحي، إلى 12 ملليمتر في 75 ملليمتر جولة أنابيب الثقافة الزجاج السفلي.
حدد واحد أو اثنين من المستعمرات من لوحة بين عشية وضحاها من البكتيريا، ووضعها في أنابيب الثقافة. دوامة الأنابيب بلطف لتعليق البكتيريا في المحلل. تحقق من تركيز البكتيريا باستخدام قارئ McFarland.
ضبط التركيز عن طريق إضافة المزيد من البكتيريا المالحة أو أكثر لتحقيق 0.5 McFarland قراءة التعكر. ثم، تمييع البكتيريا من واحد إلى 300 عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من التعليق إلى 30 ملليلتر من مرق مولر-هينتون المعدلة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للوصول إلى كثافة الخلايا النهائية من خمس مرات 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الخامسة لكل ملليلتر. الآن، إعداد مضادات الميكروبات للطباعة باتباع جنبا إلى جنب في بروتوكول النص المصاحب.
حفظ البروتوكول، ثم انقر فوق الزر تشغيل في أعلى اليسار، متبوعاً الزر ابدأ. قم بتحميل لوحة 384-well في حامل اللوحة، واضغط على Loaded تحت موجه لوحة التحميل 1 Synergy. ثم ضع T8 + كاسيت في فتحة الكاسيت، ثم اضغط على تحميل ضمن موجه تحميل T8 + Cassette.
عند المطالبة، إضافة محلول مخزون المضادات الحيوية إلى الخزانات المشار إليها على الكاسيت. بعد إضافة كل حل، اضغط على الزر "تعبئة". بمجرد أن يضيف موزع D300 مخزون المضادات الحيوية في وحدات التخزين المناسبة لكل بئر ويظهر المربع Run Completed ، انقر فوق إغلاق وإزالة اللوحة وإيقاف تشغيل D300.
بعد ذلك ، صب التعليق البكتيري المعد مسبقًا في خزان كاشف معقمة. استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكروليتر من التعليق إلى جميع الآبار في صفيف الداما. ثم، إضافة 50 ميكرولترات من مرق مولر-هينتون المعدلة بدون بكتيريا إلى بئر فارغة.
وستكون هذه هي السيطرة السلبية بشكل جيد لتأكيد عقم وسائل الإعلام. احتضان في حاضنة الهواء المحيط 35 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. لتحليل الاختبار، اتبع في بروتوكول النص المصاحب.
بالنسبة لاختبار التآزر وقت القتل، أعد مرة أخرى حلول المخزون المضاد للميكروبات كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم، وجعل تعليق 0.5 مكفارلاند من الكائن الحي اختبار في المالحة العقيمة. إضافة 100 ميكرولترات من تعليق 0.5 ماكفارلاند إلى خمسة ملليلتر من CAMHB في 25 في 150 ملليمتر الزجاج جولة أسفل أنبوب الثقافة مع إغلاق الفولاذ المقاوم للصدأ، ودوامة بلطف لخلط.
باستخدام حلقة تطعيم عقيمة ، فإن العزلة تُزال قطرة من التعليق المخفف على صفيحة أجار الدم ، وتحتضن اللوحة عند 35 درجة مئوية في الهواء المحيط لتأكيد نقاء الإخاء. استبدال الإغلاق على الأنبوب، واحتضانه في رف أنبوب اختبار على شاكر في 35 درجة مئوية في الهواء المحيط لمدة 3 ساعات على الأقل، حتى يتم التوصل إلى نمو اللوغاريتمي المرحلة. في حين أن الثقافة الأولية هي احتضان، إضافة 10 ملليلتر من مرق مولر-هينتون تعديل الموجبة إلى خمسة أنابيب ثقافة الزجاج autoclaved.
لدراسة التآزر وقت قتل, ينبغي أن يكون دواء واحد على الأقل في التركيز الذي لا يؤثر على منحنى النمو بشكل فردي. ويمكن تحديد ذلك من خلال تقييم آثار تركيزات الأدوية الفردية قبل دراسة التآزر. إلى الأنبوب الأول، إضافة 10 ميكرولترات من مخزون colistin ملليغرام واحد للحصول على تركيز colistin النهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر، وهذا هو التركيز الذي هو غير فعالة ضد سلالة المستخدمة في هذا المثال.
بالنسبة للأنبوب الثاني، أضف 10 ميكرولترات من مخزون مينوسيكلين من ملليغرام واحد لكل ملليلتر للحصول على تركيز نهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر. هذا التركيز هو أيضا غير فعالة ضد سلالة المستخدمة في هذا المثال. إلى الأنبوب الثالث، إضافة 10 ميكرولترات من مخزون مينوسيكلين واحد ملليغرام لكل ملليلتر و10 ميكرولترات من مخزون الكوليتين من ملليغرام واحد لكل ملليلتر.
هذه هي نفس الكمية من الكليستين والمينوسيكلين المستخدمة في أنابيب واحد واثنين. في الأنابيب الرابعة والخامسة، لا تضيف المضادات الحيوية. وسيكون هذا هو التحكم في النمو و السلبي أنابيب التحكم، على التوالي.
المقبل، وإعداد 96 صحون البولي بروبلين عميق جيدا مع آبار مليلتر اثنين لتخفيف المسلسل عن طريق إضافة 900 ميكرولترات من المالحة العقيمة إلى الصفوف B من خلال H من الأعمدة من واحد إلى أربعة مع ماصة متعددة القنوات. عندما تكون الثقافة في مرحلة النمو اللوغاريتمي، قم بإزالة أنبوب الثقافة من الشاكر، ودوامة بلطف. نقل ملليلتر واحد من التعليق إلى أنبوب ثقافة الزجاج 12 في 75 ملليمتر، والتحقق من الكثافة مع قارئ ماكفارلاند.
إذا كانت الكثافة أقل من 1.0 مكفارلاند، أعد الأنبوب إلى الشاكر واحتضان لفترة أطول. إذا كان أكبر من 1.0 ماكفارلاند، إضافة مرق مولر-هينتون تعديل الموجبة إلى الأنبوب، دوامة بلطف، وإعادة العينة حتى تعليق هو في 1.0 مكفارلاند. من المهم أن تكون الثقافة في مرحلة النمو اللوغاريتمي عند إعداد inoculum البداية.
يمكنك بناء منحنى النمو لتحديد متى يصل كائن حي إلى هذه المرحلة. ثم، إضافة 100 ميكرولترات من تعليق 1.0 ماكفارلاند إلى أنابيب واحد من خلال أربعة، ودوامة لهم بلطف. مباشرة بعد خلط وعلى واحد، اثنين، أربعة، ست، و 24 ساعة، وإزالة aliquot 150 ميكرولتر من كل أنبوب الثقافة عن طريق إمالة الأنبوب بحيث فقط تلميح ماص معقمة يدخل الأنبوب وليس رمح الأنابيب غير معقمة خلال الانسحاب aliquot.
أضف aliquots، على التوالي، إلى الآبار المتتالية في الصف الأول من لوحة 96 بئرًا عميقة تم إعدادها مسبقًا. عودة الأنابيب إلى رف أنبوب اختبار على شاكر في حاضنة الهواء المحيط 35 درجة مئوية مباشرة بعد إزالة aliquots في كل نقطة زمنية. باستخدام ماصة متعددة القنوات، وإزالة 100 ميكرولترات من الصف A من لوحة، وإضافته إلى الصف B، التي تحتوي على 900 ميكرولترات من المالحة، وخلق تخفيف واحد إلى 10.
الماصات الحل صعودا وهبوطا أربع إلى خمس مرات لخلط، ومن ثم تجاهل النصائح. أولاً، تسمية لوحات مولر هينتون أغار مع ظروف المضادات الحيوية والتخفيف لتكون مطلية. ثم، لوحة العينات المخففة لعدد مستعمرة باستخدام طريقة لوحة قطرة، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات مع نصائح اضافية طويلة.
إزالة 10 ميكرولترات من كل بئر في العمود واحد، والاستغناء بعناية في صف واحد على لوحة المسمى بشكل مناسب. استمر حتى يتم توزيع كافة الصفوف على لوحات. وبالإضافة إلى ذلك، في نقطة الوقت 24 ساعة، ضع قطرة 10 ميكرولتر مأخوذة مباشرة من أنبوب التحكم السلبي على بقعة مخصصة لهذا من أجل اختبار العقم.
ثم، عكس جميع لوحات، واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية في الهواء المحيط. ثم، عد عدد المستعمرات على كل منطقة، وحساب كثافة الخلية. وضع علامة على المستعمرات مع علامة دائمة دقيقة على عكس اللوحة لتجنب العد المزدوج أو المفقودين من المستعمرات.
لكل سلسلة تخفيف، تحديد قطرات مع ثلاث إلى 30 مستعمرات. عد المستعمرات في هذه القطرات، وسجل العد جنبا إلى جنب مع عامل التخفيف. يظهر هنا هو شبكة من تجربة التآزر صفيف رقعة الداما التي المينوسيكلين في تركيزات من صفر إلى 32 ميكروغرام لكل ملليلتر تم الجمع بين colistin بتركيزات من صفر إلى 16 ميكروغرام لكل ملليلتر واختبارها ضد سلالة من القولونية.
الآبار التي تقل قيمها عن 600 OD أقل من 07 لا تمثل أي نمو وهي حمراء مظللة، في حين تمثل الآبار ذات قيم OD600 أعلى أو تساوي 07 نموًا وخضراء مظللة. لكل دواء ، والحد الأدنى من تركيز المثبطة هو أدنى تركيز من المخدرات التي تمنع نمو البكتيريا. بالنسبة للمينوسكلين، هذا هو 32 ميكروغرام لكل ملليلتر، وبالنسبة للكولستين، هو ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر.
يتم الاحتفاظ بالتظليل هنا، ولكن القيم داخل الآبار التي يتم فيها تثبيط النمو يتم استبدالها بتركيز مثبط كسري، أو قيم مؤشر FIC. في كل بئر ، يتم حساب مؤشر FIC لكل دواء عن طريق قسمة تركيز المضادات الحيوية في ذلك البئر من قبل الحد الأدنى لتركيز الدواء المثبط. يشار إلى الآبار التي يقل مؤشر FIC عن 0.5 أو يساويها، والتي تعتبر قطع التآزر، بحد خط مكسور، ويتم ابرء البئر الذي به أدنى مؤشر FIC.
لأن قيمة FIC الحد الأدنى هو في نطاق التآزر، ويعتبر الجمع التآزر. ويرد هنا مثال لحالة لا تثبت التآزر، حيث أن الحد الأدنى لمؤشر FIC الذي يكبح النمو هو واحد، وهو أكبر من 0.5. وأخيراً، في هذا المثال، حدثت عدة آبار متخطية، وهو ما يمثل النمو البكتيري الذي يتم تثبيطه، على الرغم من وجود نمو بكتيري في الآبار المجاورة مع تركيزات أعلى من المضادات الحيوية.
إذا تم تخطي أكثر من واحد بشكل جيد حدث في صفيف لوحة الداما، يجب تجاهل النتائج وتكرار الفحص. مثال على الرسم البياني الذي يوضح نتائج مقايسة التآزر وقت القتل هنا. يرجى الاطلاع على بروتوكول النص المصاحب للحصول على تفاصيل حول تفسير مقايسة التآزر وقت القتل.
ويمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول نشاط مجموعات التآزر من خلال تقييمات للأدوية والديناميكية الدوائية ومن خلال دراسات في علم الفعاليات مع نماذج حيوانية. اتبع دائما إجراءات السلامة المناسبة، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية، عند العمل مع البكتيريا. إذا كنت تولد الهباء الجوي أو استخدام مسببات الأمراض عالية الخطورة، أداء جميع الأعمال في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
