Las pruebas manuales de sinergia de arreglos de discos de tablero de ajedrez son un método que requiere mucha mano de obra y se propensa a errores. Por el contrario, nuestro método automatizado de tablero de ajedrez basado en impresoras de inyección de tinta mejora drásticamente la velocidad, la precisión y el rendimiento. El método automatizado de tablero de ajedrez permite detectar un gran número de fármacos en busca de combinaciones sinérgicas, mientras que el método de eliminación del tiempo puede confirmar y explorar aún más la actividad de estas combinaciones.
El descubrimiento de nuevos antibióticos no está manteniendo el ritmo de la propagación de la resistencia, pero la investigación de combinaciones sinérgicas ofrece la posibilidad de salvar los medicamentos existentes para tratar las bacterias resistentes. Aunque demostramos esta técnica con antibacterianos, también podría utilizarse con otras clases de antimicrobianos o incluso para diferentes tipos de pruebas combinadas de fármacos o compuestos. En este vídeo, mostramos un método automatizado de matriz de tablero de ajedrez y un método manual de eliminación de tiempo.
Sugerimos realizar estudios de arreglos de cuadros de ajedrez primero para identificar combinaciones prometedoras, luego investigarlas con estudios de eliminación de tiempo. Para empezar, haga soluciones de stock antimicrobiano de colistina y minociclina, y luego realice un control de calidad en las soluciones de stock como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, agregue alrededor de un mililitro de cloruro de sodio 0,9%, solución salina, a tubos de cultivo de vidrio inferior redondo de 12 milímetros por 75 milímetros.
Seleccione una o dos colonias de una placa de bacterias durante la noche y colóquelas en los tubos de cultivo. Vórtice los tubos suavemente para suspender las bacterias en la solución. Compruebe la concentración de bacterias utilizando un lector McFarland.
Ajuste la concentración añadiendo más solución salina o más bacterias para lograr una lectura de turbidez McFarland de 0,5 McFarland. Luego, diluir las bacterias de uno a 300 añadiendo 100 microlitros de la suspensión a 30 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado por catión en un tubo cónico de 50 mililitros para alcanzar una densidad celular final de cinco veces 10 a las quintas unidades formadoras de colonias por mililitro. Ahora, prepare los antimicrobianos para la impresión siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña.
Guarde el protocolo y, a continuación, haga clic en el botón Ejecutar en la parte superior izquierda, seguido del botón Inicio. Cargue una placa de 384 pozos en el soporte de la placa y pulse Cargado bajo el indicador De la 1 Synergy de la placa de carga. A continuación, coloque un T8+cassette en la ranura del cassette y pulse Cargado bajo el indicador Cargar un T8+Cassette.
Cuando se le solicite, añada una solución de caldo de antibióticos a los depósitos indicados en el cassette. Después de agregar cada solución, presione el botón Relleno. Una vez que el dispensador D300 haya añadido caldo de antibióticos en volúmenes adecuados a cada pozo y aparezca el cuadro Ejecutar completado, haga clic en Cerrar, retire la placa y apague el D300.
A continuación, vierta la suspensión bacteriana previamente preparada en un depósito de reactivos estériles. Utilice una pipeta multicanal para añadir 50 microlitros de la suspensión a todos los pozos de la matriz del tablero de ajedrez. A continuación, agregue 50 microlitros de caldo Mueller-Hinton ajustado por catión sin bacterias a un pozo vacío.
Este será el pozo de control negativo para confirmar la esterilidad de los medios de comunicación. Incubar en una incubadora de aire ambiente de 35 grados Celsius durante 16 a 20 horas. Para analizar la prueba, siga el protocolo de texto que lo acompaña.
Para la prueba de sinergia de tiempo-muerte, prepare de nuevo las soluciones de stock antimicrobiano como se describe en el protocolo de texto. A continuación, haga una suspensión 0.5 McFarland del organismo de prueba en solución salina estéril. Añada 100 microlitros de la suspensión 0.5 McFarland a cinco mililitros de CAMHB en un tubo de cultivo de fondo redondo de vidrio de 25 por 150 milímetros con cierre de acero inoxidable y vórtice suavemente para mezclar.
Usando un lazo de inoculación estéril, el aislamiento raya una gota de la suspensión diluida sobre una placa de agar sangre, e incuba la placa a 35 grados Celsius en aire ambiente para confirmar la pureza del inóculo. Reemplace el cierre del tubo e icírelo en un bastidor de tubo de ensayo en una coctelera a 35 grados Celsius en aire ambiente durante al menos 3 horas, hasta que se alcance el crecimiento en fase logarítmica. Mientras el cultivo inicial está incubando, agregue 10 mililitros de caldo Mueller-Hinton ajustado por catión a cinco tubos de cultivo de vidrio autoclavado.
Para un estudio de sinergia de muerte en el tiempo, al menos un medicamento debe estar en una concentración que no afecta a la curva de crecimiento individualmente. Esto se puede determinar mediante la evaluación de los efectos de las concentraciones de drogas individuales antes del estudio de sinergia. Al primer tubo, añadir 10 microlitros de una existencia de colistina de un miligramo por mililitro para obtener una concentración final de colistina de un microgramo por mililitro, ya que se trata de una concentración que es ineficaz contra la cepa utilizada en este ejemplo.
Para el segundo tubo, añadir 10 microlitros de un miligramo de miligramo de minociclina para obtener una concentración final de un microgramo por mililitro. Esta concentración también es ineficaz contra la cepa que se utiliza en este ejemplo. Al tercer tubo, agregue 10 microlitros de stock de minociclina de un miligramo por mililitro y 10 microlitros de stock de colistina de un miligramo por mililitro.
Esta es la misma cantidad de colistina y minociclina utilizada en los tubos uno y dos. En el cuarto y quinto tubos, no agregue antibióticos. Este será el control de crecimiento y los tubos de control negativos, respectivamente.
A continuación, prepare 96 placas de polipropileno de pozo profundo con pozos de dos mililitros para diluciones en serie añadiendo 900 microlitros de solución salina estéril a las filas B a H de las columnas uno a cuatro con una pipeta multicanal. Cuando el cultivo esté en fase de crecimiento logarítmico, retire el tubo de cultivo de la coctelera y vórtice suavemente. Transfiera un mililitro de la suspensión a un tubo de cultivo de vidrio de 12 por 75 milímetros y compruebe la densidad con un lector McFarland.
Si la densidad es inferior a 1,0 McFarland, vuelva a colocar el tubo en la coctelera e incubar durante más tiempo. Si es mayor que 1.0 McFarland, agregue el caldo Mueller-Hinton ajustado por catión al tubo, el vórtice suavemente y vuelva a muestrear hasta que la suspensión esté en 1.0 McFarland. Es importante que la cultura esté en la fase de crecimiento logarítmico al preparar el inóculo inicial.
Puede construir una curva de crecimiento para determinar cuándo un organismo alcanza esta fase. A continuación, agregue 100 microlitros de la suspensión 1.0 McFarland a los tubos uno a cuatro, y vórqueles suavemente. Inmediatamente después de mezclar y en una, dos, cuatro, seis y 24 horas, retire una alícuota de 150 microlitros de cada tubo de cultivo inclinando el tubo de modo que sólo la punta de pipeta estéril entre en el tubo y no el eje del pipetor no estéril durante la retirada de aliquot.
Añadir alícuotas, respectivamente, a pozos consecutivos en la primera fila de la placa de 96 pozos profundos previamente preparada. Devuelva los tubos a un bastidor del tubo de ensayo en una coctelera en una incubadora de aire ambiente de 35 grados Celsius inmediatamente después de retirar las alícuotas en cada momento. Con una pipeta multicanal, retire 100 microlitros de la fila A de la placa y agréguelo a la fila B, que contiene 900 microlitros de solución salina, creando una dilución de uno a 10.
Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo de cuatro a cinco veces para mezclar, y luego desechar las puntas. En primer lugar, etiquetar las placas de agar Mueller-Hinton con las condiciones antibióticas y la dilución a chapar. A continuación, plato de las muestras diluidas para recuentos de colonias utilizando el método de placa de gota, utilizando una pipeta multicanal con puntas extra largas.
Retire 10 microlitros de cada pozo en la columna uno, y dispensar cuidadosamente en una fila sobre la placa debidamente etiquetada. Continúe hasta que todas las filas se dispensan en las placas. Además, en el punto de tiempo de 24 horas, coloque una caída de 10 microlitsión tomada directamente del tubo de control negativo en el punto dedicado para esto con el fin de probar la esterilidad.
Luego, invierta todas las placas, e incubarlas durante la noche a 35 grados centígrados en el aire ambiente. A continuación, cuente el número de colonias en cada área y calcule la densidad celular. Marque las colonias con un marcador permanente de punta fina en el reverso de la placa para evitar el doble conteo o las colonias que faltan.
Para cada serie de dilución, identifique las gotas con tres a 30 colonias. Cuente las colonias en estas gotas, y registre el conteo junto con el factor de dilución. Aquí se muestra una cuadrícula de un experimento de sinergia de matriz de tablero de ajedrez en el que la minociclina en concentraciones de cero a 32 microgramos por mililitro se combinó con colistina a concentraciones de cero a 16 microgramos por mililitro y se probó contra una cepa de E.coli.
Los pozos con valores OD600 por debajo de 07 no representan ningún crecimiento y están sombreados de rojo, mientras que los pozos con valores OD600 por encima o igual a 07 representan el crecimiento y están sombreados de color verde sombreado. Para cada fármaco, la concentración inhibitorina mínima es la concentración más baja de fármaco que inhibe el crecimiento bacteriano. Para la minociclina, esto es 32 microgramos por mililitro, y para la colistina, es de ocho microgramos por mililitro.
El sombreado se conserva aquí, pero los valores dentro de los pozos en los que se inhibe el crecimiento se reemplazan por la concentración inhibitoria fraccionaria, o FIC, valores de índice. En cada pozo, el índice DE FIC de cada medicamento se calcula dividiendo la concentración de antibiótico en ese pozo por la concentración inhibitoria mínima de la droga. Los pozos con un índice FIC inferior o igual a 0,5, que se considera el límite para la sinergia, se indican con un borde de línea rota, y el pozo con el índice FIC más bajo está en negrita.
Dado que el valor mínimo de FIC está en el rango sinérgico, la combinación se considera sinérgica. Un ejemplo de un caso que no demuestra sinergia se muestra aquí, ya que el índice mínimo de FIC en el que se inhibe el crecimiento es uno, que es mayor que 0,5. Finalmente, en este ejemplo, se produjeron varios pozos omitidos, lo que representa un crecimiento bacteriano que se inhibe, a pesar de la presencia de crecimiento bacteriano en pozos adyacentes con mayores concentraciones de antibióticos.
Si se ha producido más de un bien omitido en una matriz de tablero de ajedrez, los resultados deben descartarse y repetirse el ensayo. Aquí se presenta un ejemplo de un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de sinergia de muerte en el tiempo. Consulte el protocolo de texto adjunto para obtener más información sobre la interpretación del ensayo de sinergia de muerte en el tiempo.
Se puede obtener más información sobre la actividad de las combinaciones sinérgicas a través de evaluaciones de farmacocinética y farmacodinámica y a través de estudios in vivo con modelos animales. Siga siempre los procedimientos de seguridad adecuados, incluido el uso de equipos de protección personal, cuando trabaje con bacterias. Si genera aerosoles o utiliza patógenos de alto riesgo, realice todo el trabajo en un gabinete de bioseguridad.
