수동 바둑판 어레이 시너지 테스트는 노동 집약적이고 오류가 발생하기 쉬운 방법입니다. 반면, 자동화된 잉크젯 프린터 기반 바둑판 방식은 속도, 정확성 및 처리량을 크게 향상시킵니다. 자동화된 체크보드 방법을 사용하면 시너지 조합에 대해 많은 수의 약물을 선별할 수 있으며, 시간 kill 방법은 이러한 조합의 활성을 확인하고 추가로 탐색할 수 있습니다.
새로운 항생 발견은 저항의 퍼짐과 보조를 맞추지 않고, 시너지 조합의 조사는 저항하는 박테리아를 취급하기 위하여 기존 약을 구원하기 위한 가능성을 제안합니다. 우리는 항균제와 이 기술을 보여주기더라도, 또한 항균제의 그밖 종류와 또는 조합 약 또는 화합물 시험의 다른 모형을 위해 사용될 수 있었습니다. 이 비디오에서는 자동 식수판 배열 방법과 수동 시간 kill 방법을 보여 줍니다.
먼저 바둑판 어레이 연구를 수행하여 유망한 조합을 식별한 다음 시간 별 검사 연구를 통해 이러한 연구를 더 조사하는 것이 좋습니다. 먼저, colistin 및 minocycline의 항균 스톡 솔루션을 만들고, 다음 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 스톡 솔루션에 대한 품질 관리를 수행합니다. 다음으로, 염화 나트륨 0.9%의 약 1밀리리터를 12mm-75mm 원형 하단 유리 배양 튜브에 추가합니다.
박테리아의 하룻밤 접시에서 하나 또는 두 개의 식민지를 선택, 배양 튜브에 배치. 용액에 있는 박테리아를 중단하기 위하여 관을 부드럽게 소용돌이. 맥팔랜드 독자를 사용하여 박테리아의 농도를 확인합니다.
0.5 맥팔랜드 탁도 판독을 달성하기 위해 더 많은 식염수 이상의 박테리아를 추가하여 농도를 조정합니다. 이어서, 50밀리리터 원추형 튜브에 30밀리리터의 정량 조정 된 뮬러-힌턴 국물에 서스펜션의 100 마이크로리터를 추가하여 1-300까지 박테리아를 희석시켜 밀리리터당 5배 10의 최종 세포 밀도에 도달한다. 이제 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 인쇄용 항균제를 준비합니다.
프로토콜을 저장한 다음 왼쪽 상단의 실행 버튼을 클릭한 다음 시작 단추를 클릭합니다. 플레이트 홀더에 384웰 플레이트를 적재하고 로드 플레이트 1 시너지 프롬프트 아래에 적재된 프레스를 누릅니다. 그런 다음 T8+카세트를 카세트 슬롯에 넣고 T8+카세트 프롬프트로드 아래에 로드된 누릅니다.
메시지가 표시되면 카세트의 표시된 저장소에 항생제 스톡 솔루션을 추가하십시오. 각 솔루션이 추가된 후 채워진 버튼을 누릅니다. D300 디스펜서가 각 우물에 적절한 볼륨에 항생제 재고를 추가하고 실행 완료 상자가 나타나면 닫기를 클릭하고 플레이트를 제거하고 D300을 끕니다.
다음으로, 이전에 준비된 세균 현탁액을 멸균 시약 저장소에 붓습니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 체크무늬 배열의 모든 우물에 서스펜션 의 50 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 박테리아없이 양이온 조정 된 뮬러 힌턴 국물 50 마이크로 리터를 빈 우물에 추가하십시오.
이것은 미디어의 멸균을 확인하기 위해 음의 통제가 잘 될 것입니다. 섭씨 35도 의 대기 인큐베이터에서 16~20시간 동안 배양합니다. 테스트를 분석하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라가십시오.
시간-킬 시너지 테스트를 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 항균 스톡 솔루션을 다시 준비합니다. 이어서, 멸균식염수에서 시험 유기체의 0.5 맥팔랜드 현탁액을 만든다. 0.5 McFarland 서스펜션의 마이크로리터 100을 25x150mm 유리 라운드 바닥 배양 튜브에 25x150mm 유리 바닥 배양 튜브에 스테인레스 스틸 클로저와 함께 부드럽게 혼합할 수 있는 100마이크로리터를 추가합니다.
멸균 접종 루프를 사용하여 희석된 현탁액한 한 방울을 혈액 식기판에 적어, 주변 공기에서 섭씨 35도에서 플레이트를 배양하여 접종 순도를 확인합니다. 튜브의 폐쇄를 교체하고, 로그산학상 성장에 도달할 때까지 적어도 3시간 동안 주변 공기에서 35도의 셰이커에 있는 시험관 랙에 배양한다. 초기 문화가 배양하는 동안, 5개의 오토클레이브 유리 배양 튜브에 양이온 조정 된 뮬러 힌턴 국물 10 밀리리터를 추가하십시오.
시간 살인 시너지 연구를 위해, 적어도 하나의 약물은 개별적으로 성장 곡선에 영향을 미치지 않는 농도에 있어야합니다. 이는 시너지 연구 전에 개별 약물 농도의 효과를 평가함으로써 결정될 수 있다. 첫 번째 튜브에, 밀리리터 당 1 밀리그램 당 colistin 스톡의 10 마이크로 리터를 추가하여 밀리리터 당 1 마이크로그램의 최종 colistin 농도를 얻으며, 이는 이 예에서 사용되는 균주에 대해 효과가 없는 농도이기 때문이다.
두 번째 튜브의 경우 밀리리터당 1밀리그램당 1밀리그램의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 이 농도는 또한 이 예에서 사용되는 균주에 대해 효과가 없습니다. 세 번째 튜브에 밀리리터 당 1밀리그램-미노사이클린 스톡 10마이크로리터와 밀리리터당 1밀리그램의 마이크로리터를 1밀리리터 당 콜리신 스톡에 추가합니다.
이것은 튜브 1개와 2개에서 사용되는 콜리신과 미노사이클린의 동일한 양입니다. 네 번째와 다섯 번째 튜브에서는 항생제를 추가하지 않습니다. 이것은 각각 성장 제어 및 부정적인 제어 튜브가 될 것입니다.
다음으로, 96개의 딥웰 폴리프로필렌 플레이트와 2밀리리터 웰을 사용하여 연속 희석을 위해 900마이크로리터의 멸균 식염수를 1~4개의 열로 B행에 추가하여 다중 채널 파이펫으로 1~4개의 열로 B행을 제공합니다. 문화권이 로그산학 성장 단계에 있을 때, 셰이커에서 배양 튜브를 제거하고 부드럽게 소용돌이시다. 서스펜션의 1밀리리터를 12x75mm 유리 배양 튜브로 옮기고 McFarland 판독기로 밀도를 확인합니다.
밀도가 1.0 McFarland 미만인 경우 튜브를 셰이커로 반환하고 더 오래 배양합니다. 1.0 McFarland보다 큰 경우, 정지가 1.0 McFarland에있을 때까지 튜브, 소용돌이 부드럽게 소용돌이 및 다시 샘플링에 양이온 조정 뮬러 힌턴 국물을 추가합니다. 시작 무분동을 준비할 때 문화가 로그자리트 성장 단계에 있는 것이 중요합니다.
성장 곡선을 구성하여 유기체가 이 단계에 도달하는 시기를 결정할 수 있습니다. 그런 다음 1.0 McFarland 서스펜션의 100 마이크로리터를 1~4개의 튜브에 넣고 부드럽게 소용돌이시다. 혼합 직후, 1, 2, 4, 6 및 24시간, 각 배양 튜브에서 150 마이크로리터 알리코트를 제거하여 멸균 파이펫 팁만 튜브에 들어가고 알리쿼트 철수 시 멸균되지 않은 피펫터 샤프트가 들어오게 한다.
알리쿼트( aliquots)를 각각 96개의 딥웰 플레이트의 첫 번째 행에 연속 우물에 넣습니다. 각 지점에서 알리쿼트를 제거한 직후 35도 섭씨 주변 공기 인큐베이터의 셰이커에 튜브를 테스트 튜브 랙으로 반환합니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 플레이트 의 행 A에서 100마이크로리터를 제거하고 900마이크로리터의 식염수를 포함하는 행 B에 추가하여 1대 10 희석을 생성합니다.
용액을 위아래로 4~5회 위아래로 피펫하여 혼합한 다음 팁을 버립니다. 첫째, 항생제 조건과 희석을 가진 뮬러-힌튼 천 접시를 도금할 라벨. 그런 다음, 추가 길이의 팁이 있는 멀티채널 파이펫을 사용하여 드롭 플레이트 방법을 사용하여 콜로니 카운트용 희석된 샘플을 플레이트로 플레이트한다.
각 웰에서 마이크로리터 10개를 제거하고 적절하게 표시된 플레이트에 연속으로 조심스럽게 분배합니다. 모든 행이 플레이트에 분배될 때까지 계속합니다. 또한, 24시간 시점에서, 음의 대조관으로부터 직접 가져온 10마이크로리터 드롭을 이를 위해 전용 지점에 놓아 멸균을 테스트한다.
그런 다음 모든 판을 반전시키고 밤새 주변 공기에서 섭씨 35도에서 배양하십시오. 그런 다음 각 영역에 있는 콜로니 수를 계산하고 세포 밀도를 계산합니다. 이중 계수 또는 누락된 식민지를 피하기 위해 플레이트 뒷면에 미세 팁 영구 마커로 식민지를 표시하십시오.
각 희석 계열에 대해 3~30개의 콜로니로 방울을 식별합니다. 이 방울에서 식민지를 계산하고 희석 계수와 함께 카운트를 기록합니다. 여기에 표시된 체크어판 어레이 시너지 실험에서 밀리리터 당 0 ~32 마이크로그램의 농도에서 미노사이클린이 밀리리터당 0~16마이크로그램의 농도에서 콜리신과 결합되어 E.coli의 균주에 대해 테스트하였다.
OD600 값이 07 미만인 웰은 성장을 나타내지 않으며 빨간색으로 차드되고 OD600 값이 07과 같으면 성장이 나타내고 녹색으로 그늘이 있습니다. 각 약물에 대해, 최소 억제 농도는 세균 성장을 억제하는 약물의 가장 낮은 농도이다. 미노사이클린의 경우 밀리리터당 32마이크로그램이며, 콜리신의 경우 밀리리터당 8마이크로그램입니다.
섀도링은 여기서 유지되지만 성장이 억제되는 우물 내의 값은 분수 억제 농도 또는 FIC, 인덱스 값으로 대체됩니다. 각 음에서, 각 약물의 FIC 지수는 약물의 최소 억제 농도에 의해 잘 항생제의 농도를 분할하여 계산됩니다. 시너지 효과를 위한 컷오프로 간주되는 FIC 지수가 0.5 미만이거나 동일한 우물은 깨진 선 테두리로 표시되며, FIC 지수가 가장 낮은 우물은 굵게 표시됩니다.
최소 FIC 값은 시너지 범위에 있기 때문에 조합이 시너지 효과로 간주됩니다. 성장이 억제되는 최소 FIC 지수가 0.5보다 큰 최소 FIC 지수이기 때문에 시너지 효과를 입증하지 못하는 사례의 예가 여기에 나와 있다. 마지막으로, 이 예에서, 몇몇 건너뛴 우물은 항생제의 높은 농도를 가진 인접한 우물에 있는 세균성장의 존재에도 불구하고, 억제되는 세균성 성장을 나타내는, 일어났습니다.
체크 보드 배열에서 두 개 이상의 건너뛰기 잘 건너 뛴 경우 결과를 폐기하고 분석이 반복되어야합니다. 시간 살인 시너지 분석의 결과를 보여주는 그래프의 예가 여기에 제시되어 있습니다. 시간 살인 시너지 분석의 해석에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.
시너지 조합의 활성에 대한 추가 정보는 약동학 및 약물 역학의 평가를 통해 동물 모델과의 생체 내 연구를 통해 얻을 수 있다. 박테리아로 작업 할 때 항상 개인 보호 장비의 사용을 포함하여 적절한 안전 절차를 따르십시오. 에어로졸을 생성하거나 고위험 병원균을 사용하는 경우 생물 안전 캐비닛에서 모든 작업을 수행하십시오.
