Ручное тестирование синергии клетчатого массива является трудоемким и подверженным ошибкам методом. В отличие от этого, наш автоматизированный метод струйного принтера на основе шахматной доски значительно повышает скорость, точность и пропускную способность. Автоматизированный метод шахматной доски позволяет проверять большое количество препаратов на синергетический комбинаций, в то время как метод тайм-убить может подтвердить и продолжить изучение активности этих комбинаций.
Новое открытие антибиотиков не поспевает за распространением резистентности, но исследование синергетических комбинаций дает возможность для спасения существующих препаратов для лечения резистентных бактерий. Хотя мы демонстрируем этот метод с антибактериальных препаратов, он также может быть использован с другими классами противомикробных препаратов или даже для различных типов комбинированных наркотиков или соединения тестирования. В этом видео мы демонстрируем автоматизированный метод массива шахматной доски и ручной метод убить время.
Мы предлагаем сначала проработать исследования клетчатого массива для выявления перспективных комбинаций, а затем исследовать их с помощью исследований, убивающих время. Для начала сделайте противомикробные решения из колистина и миноциклина, а затем выполните контроль качества на фондовых растворах, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее добавьте около одного миллилитра 0,9% хлорида натрия, солевого раствора, до 12-миллиметровых на 75-миллиметровых круглых трубок культуры нижнего стекла.
Выберите одну или две колонии из ночной пластины бактерий, и поместите их в культуру труб. Vortex трубки осторожно приостановить бактерий в растворе. Проверьте концентрацию бактерий с помощью читателя McFarland.
Отрегулируйте концентрацию путем добавлять больше солевого раствора или больше бактерий для того чтобы достигнуть чтения мутности McFarland 0.5. Затем разбавляйте бактерии от одного до 300, добавляя 100 микролитров подвески до 30 миллилитров катиона-скорректированного бульона Мюллер-Хинтон в 50-миллилитровой конической трубке, чтобы достичь конечной плотности клеток в пять раз от 10 до пятой колонии формирования единиц на миллилитр. Теперь подготовь противомикробные препараты для печати, следуя сопроводительному текстовому протоколу.
Сохраните протокол, а затем нажмите на кнопку Run в левом верхнем слева, а затем кнопку «Пуск». Загрузите пластину 384-хорошо в держатель пластины, и нажмите загружены под нагрузкой плиты 1 Синергия подсказка. Затем поместите кассету T8'cassette в слот для кассеты и нажмите на него, загруженное под подсказкой T8-Cassette.
При запросе добавьте раствор запасов антибиотиков в указанные резервуары на кассете. После добавления каждого решения нажмите кнопку Filled. После того, как D300 Диспенсер добавил запас антибиотиков в соответствующих объемах для каждой хорошо и Run Completed поле появляется, нажмите Закрыть, удалить пластину, и выключить D300.
Далее вылейте затыкаемую ранее бактериальную суспензию в стерильный резервуар реагентов. Используйте многоканальный пипетку, чтобы добавить 50 микролитров подвески ко всем колодцам в шахматном массиве. Затем добавьте 50 микролитров бульона Мюллер-Хинтон без бактерий в пустой колодец.
Это будет негативный контроль хорошо, чтобы подтвердить стерильность средств массовой информации. Инкубировать в 35-градусный инкубатор окружающего воздуха по Цельсию в течение 16 до 20 часов. Чтобы проанализировать тест, следуйте сопроводительному текстовому протоколу.
Для теста синергии тайм-убить, снова подготовить решения противомикробных запасов, как описано в текстовом протоколе. Затем сделайте 0,5 Макфарланд подвески испытательного организма в стерильном соле. Добавьте 100 микролитров подвески 0,5 McFarland в пять миллилитров CAMHB в 25-на-150-миллиметровой стеклянной круглой нижней культуре трубки с закрытием из нержавеющей стали, и вихрь аккуратно перемешать.
Используя стерильную инокулятную петлю, изоляционная полоса капли разбавленной суспензии на пластину агара крови, и инкубировать пластину при температуре 35 градусов по Цельсию в окружающем воздухе, чтобы подтвердить чистоту инокулы. Замените замыкание на трубке и инкубировать его в стойке пробирки на шейкере при температуре 35 градусов по Цельсию в окружающем воздухе в течение по крайней мере 3 часов, пока не будет достигнут рост логаритмической фазы. В то время как начальная культура инкубируется, добавьте 10 миллилитров бульона Мюллер-Хинтон с поправкой на катион до пяти автоматических стеклянных трубок культуры.
Для исследования синергии тайм-убить, по крайней мере один препарат должен быть в концентрации, которая не влияет на кривую роста индивидуально. Это может быть определено путем оценки воздействия отдельных концентраций наркотиков до исследования синергии. К первой трубке добавьте 10 микролитров запасов колистина по миллиграмму на миллилитр, чтобы получить окончательную концентрацию колистина в один микрограмм на миллилитр, так как это концентрация, которая неэффективна против штамма, используемого в данном примере.
Для второй трубки добавьте 10 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр миноциклина, чтобы получить окончательную концентрацию в один микрограмм на миллилитр. Эта концентрация также неэффективна против штамма, используемого в этом примере. К третьей трубке добавьте 10 микролитров одного миллиграмма на миллилитр миноциклина и 10 микролитров запаса колистина по миллиграмму на миллилитр.
Это такое же количество колистина и миноциклина, используемых в трубках один и два. В четвертой и пятой трубках не добавляйте антибиотиков. Это будет контроль роста и отрицательные трубы контроля, соответственно.
Далее подготовьте 96 глубоководных полипропиленовых пластин с двухмиллилитровыми скважинами для серийных разбавлений, добавив 900 микролитров стерильного солевого раствора в ряды B через H колонн от одного до четырех с многоканальной пипеткой. Когда культура находится в фазе логаритмического роста, удалите культурную трубку из шейкера и аккуратно вихрем. Перенесите один миллилитр подвески на трубку культуры стекла 12 на 75 миллиметров и проверьте плотность с помощью считыватель McFarland.
Если плотность меньше 1,0 Макфарланда, верните трубку в шейкер и инкубировать дольше. Если он больше, чем 1,0 McFarland, добавить катиона скорректированы Мюллер-Хинтон бульон в трубку, вихрь мягко, и повторно образец, пока подвеска находится на 1,0 McFarland. Важно, чтобы культура была в фазе логаритмического роста при подготовке стартового инокулума.
Вы можете построить кривую роста, чтобы определить, когда организм достигает этой фазы. Затем добавьте 100 микролитров подвески 1.0 McFarland к трубам от одного до четырех и аккуратно вихрем. Сразу же после смешивания и в один, два, четыре, шесть и 24 часов, удалить 150-микролитер aliquot из каждой культуры трубки, наклоняя трубку так, что только стерильные пипетки кончик входит в трубку, а не нестерильный трубчатый вал во время вывода aliquot.
Добавьте aliquots, соответственно, к последовательным скважинам в первом ряду ранее подготовленной пластины 96 глубоководных скважин. Вернуть трубки в стойку пробирки на шейкере в 35-градусный инкубатор окружающего воздуха по Цельсию сразу после удаления aliquots в каждой точке времени. Используя многоканальный пипетку, удалите 100 микролитров из ряда А пластины и добавьте ее в ряд B, содержащий 900 микролитров солевого раствора, создавая разбавление от одного до 10.
Pipette раствор вверх и вниз четыре-пять раз, чтобы смешать, а затем отказаться от кончиков. Во-первых, этикетка Мюллер-Хинтон агар пластин с антибиотиками условиях и разбавления, которые будут побыты. Затем пластина разбавленных образцов для колонии рассчитывает с помощью метода падение пластины, используя многоканальный пипетку с экстра-длинные советы.
Удалите 10 микролитров из каждой хорошо в столбце один, и обойтись осторожно в ряд на соответствующим помечены пластины. Продолжайте до тех пор, пока все строки не будут высасыться на пластины. Кроме того, в 24-часовой момент времени, место 10-микролитер падение взято непосредственно из отрицательной трубки управления на месте, предназначенных для этого для того, чтобы проверить на бесплодие.
Затем инвертировать все пластины, и инкубировать их на ночь при температуре 35 градусов по Цельсию в окружающем воздухе. Затем подсчитайте количество колоний на каждой области и вычислите плотность клеток. Отметь колонии с постоянным маркером тонкой наконечника на реверсе пластины, чтобы избежать двойного подсчета или отсутствующих колоний.
Для каждой серии разбавления определите капли с тремя-30 колониями. Подсчитайте колонии в этих каплях и завестите количество вместе с фактором разбавления. Здесь показана сетка из эксперимента по синергии шахматного массива, в котором миноциклин в концентрациях от нуля до 32 микрограмм на миллилитр сочетается с колистином при концентрациях от нуля до 16 микрограмм на миллилитр и тестируется против штамма E.coli.
Скважины со значениями OD600 ниже 07 не представляют роста и затенены красным цветом, в то время как скважины со значениями OD600 выше или равны 07 представляют рост и затенены зеленым цветом. Для каждого препарата минимальная ингибирующая концентрация является самой низкой концентрацией препарата, который подавляет рост бактерий. Для миноциклина это 32 микрограмма на миллилитр, а для колистина - восемь микрограмм на миллилитр.
Затенение сохраняется здесь, но значения в скважинах, в которых тормозится рост, заменяются дробной ингибирующей концентрацией, или значениями индекса FIC. В каждой хорошо, FIC индекс каждого препарата рассчитывается путем деления концентрации антибиотиков в том, что хорошо минимальной ингибирующей концентрации препарата. Скважины с индексом FIC менее или равны 0,5, который считается вырезом для синергии, обозначены с разбитой границей, а скважина с самым низким индексом FIC схмеяна.
Поскольку минимальное значение FIC находится в синергетическом диапазоне, комбинация считается синергетической. Здесь приводится пример случая, не продемонстрировав синергии, поскольку минимальный индекс FIC, при котором тормозится рост, превышает 0,5. Наконец, в этом примере произошло несколько пропущенных скважин, что представляет собой ингибируется бактериальный рост, несмотря на наличие бактериального роста в соседних скважинах с более высокими концентрациями антибиотиков.
Если более одного пропущенного хорошо произошло в шахматном массиве, результаты должны быть отброшены и анализ повторяется. Здесь представлен пример графика, демонстрирующего результаты анализа синергии тайм-убить. Пожалуйста, посмотрите сопроводительный текстовый протокол для получения подробной информации о толковании анализа синергии тайм-убить.
Дополнительную информацию о деятельности синергетических комбинаций можно получить путем оценки фармакокинетики и фармакодинамики, а также через исследования in vivo с животными моделями. Всегда следуйте соответствующим процедурам безопасности, включая использование средств индивидуальной защиты, при работе с бактериями. Если вы производите аэрозоли или используете патогенные микроорганизмы высокого риска, выполняйте все работы в кабинете биобезопасности.
