בדיקת סינרגיה ידנית של מערך לוח השחמט היא שיטה עתירת עבודה ונוטה לשגיאות. לעומת זאת, שיטת לוח השחמט האוטומטית שלנו המבוססת על מדפסת הזרקת דיו משפרת באופן דרמטי את המהירות, הדיוק והתפוקה. שיטת לוח השחמט האוטומטי מאפשרת לסנן מספר רב של תרופות לשילובים סינרגטיים, בעוד ששיטת ההרג בזמן יכולה לאשר ולחקור עוד יותר את הפעילות של שילובים אלה.
תגלית אנטיביוטית חדשנית אינה עומדת בקצב התפשטות ההתנגדות, אך חקירת שילובים סינרגטיים מציעה אפשרות להצלת תרופות קיימות לטיפול בחיידקים עמידים. למרות שאנו מדגימים טכניקה זו עם אנטיבקטריאליים, זה יכול לשמש גם עם סוגים אחרים של מיקרוביאלית או אפילו עבור סוגים שונים של תרופות משולבות או בדיקות מורכבות. בסרטון וידאו זה, אנו מדגימים שיטת מערך לוח שחמט אוטומטית ושיטת הרג ידנית בזמן.
אנו ממליצים לבצע תחילה מחקרים במערך לוח השחמט כדי לזהות שילובים מבטיחים, ולאחר מכן לחקור אותם עוד יותר עם מחקרים על הרג בזמן. כדי להתחיל, לעשות פתרונות מלאי מיקרוביאלית של קוליסטין ו minocycline, ולאחר מכן לבצע בקרת איכות על פתרונות המניות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, הוסיפו כמיליליטר אחד של 0.9% נתרן כלורי, מלוחים, לצינורות תרבות זכוכית עגולים 12 מ"מ על 75 מ"מ.
בחר מושבה אחת או שתיים מצלחת לילה של חיידקים, והצב אותם לתוך צינורות התרבות. מערבולת הצינורות בעדינות להשעות את החיידקים בתסרון. בדוק את ריכוז החיידקים באמצעות קורא מקפרלנד.
התאימו את הריכוז על ידי הוספת עוד חיידקים מלוחים או יותר כדי להשיג קריאת עגימות של 0.5 מקפרלנד. לאחר מכן, לדלל את החיידקים אחד עד 300 על ידי הוספת 100 microliters של ההשעיה ל 30 מיליליטר של מרק מיולר-הינטון מותאם יון בצינור חרוט 50 מיליליטר כדי להגיע לצפיפות תאים סופית של חמש פעמים 10 ליחידות יוצרות המושבה החמישית למיליליטר. עכשיו, להכין את מיקרוביאלית להדפסה על ידי ביצוע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
שמור את הפרוטוקול ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעל בחלק הימני העליון ואחריו על לחצן התחל. טען צלחת 384 באר לתוך מחזיק הצלחת, ולחץ טעון תחת לוח עומס 1 סינרגיה בקשה. לאחר מכן, מקם קלטת T8+בחריץ המגירה והקש Loaded תחת שורת הפקודה טען T8+Cassette.
כאשר תתבקש, להוסיף פתרון מלאי אנטיביוטי למאגרים שצוינו על הקלטת. לאחר הוספת כל פתרון, לחץ על לחצן מלא. לאחר שמתקן D300 הוסיף מלאי אנטיביוטי בנפחים מתאימים לכל באר והתיבה הפעל הושלמה מופיעה, לחץ על סגור, הסר את הצלחת וכבה את D300.
לאחר מכן, יוצקים את ההשעיה החיידקית שהוכנה בעבר לתוך מאגר ריג'נט סטרילי. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להוסיף 50 microliters של ההשעיה לכל בארות במערך לוח השחמט. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מרק מיולר-הינטון מותאם הקטיון ללא חיידקים ל באר ריקה.
זו תהיה באר השליטה השלילית כדי לאשר את הסטריליות של התקשורת. דגירה באינקובטור אוויר אוויר 35 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות. כדי לנתח את הבדיקה, בצע בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
לבדיקת הסינרגיה בזמן להרוג, שוב להכין את פתרונות מלאי מיקרוביאלית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לעשות השעיה 0.5 מקפרלנד של אורגניזם הבדיקה מלוחים סטריליים. הוסף 100 microliters של ההשעיה 0.5 מקפרלנד לחמישה מיליליטר של CAMHB בצינור תרבות עגול זכוכית 25 על 150 מ"מ עם סגירת נירוסטה, ומערבולת בעדינות לערבב.
באמצעות לולאת תוסנה סטרילית, בידוד פס טיפה של ההשעיה מדולל על צלחת אגר דם, ודגירה את הצלחת ב 35 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה כדי לאשר טוהר inoculum. החלף את הסגר על הצינור, ודגירה אותו במתלה מבחנה על שייקר ב 35 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה לפחות 3 שעות, עד צמיחה בשלב לוגריתמי הוא הגיע. בעוד התרבות הראשונית היא דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של מרק מיולר-הינטון מותאם קטיונים לחמישה צינורות תרבות זכוכית autoclaved.
עבור מחקר סינרגיה להרוג זמן, לפחות תרופה אחת צריכה להיות בריכוז שאינו משפיע על עקומת הצמיחה בנפרד. זה יכול להיקבע על ידי הערכת ההשפעות של ריכוזי תרופות בודדים לפני המחקר סינרגיה. לצינור הראשון, להוסיף 10 microliters של אחד מיליגרם למיליליטר קוליסטין מלאי כדי לקבל ריכוז קוליסטין סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר, כמו זה ריכוז כי הוא לא יעיל נגד המתח המשמש בדוגמה זו.
עבור הצינור השני, להוסיף 10 microliters של אחד מיליגרם למיליליטר minocycline מלאי כדי לקבל ריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. ריכוז זה אינו יעיל גם נגד המתח המשמש בדוגמה זו. לצינור השלישי, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מלאי מינוצ'ין של מיליגרם למיליליטר ו-10 מיקרוליטרים של מניית קוליסטין של מיליגרם למיליליטר.
זוהי אותה כמות של קוליסטין ו minocycline המשמש צינורות 1 ו -2. בצינורות הרביעי והחמישי, אין להוסיף אנטיביוטיקה. זו תהיה בקרת הצמיחה וצינורות הבקרה השליליים, בהתאמה.
לאחר מכן, הכינו 96 צלחות פוליפרופילן עמוקות עם שתי בארות מיליליטר לדילול סדרתי על ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של תמיסת מלח סטרילית לשורות B דרך H של עמודים 1 עד 4 עם פיפטה רב ערוצית. כאשר התרבות נמצאת בשלב צמיחה לוגריתמית, הסר את צינור התרבות מהשייקר, ומערבולת אותו בעדינות. העבר מיליליטר אחד של ההשעיה לצינור תרבות זכוכית 12 על 75 מילימטר, ולבדוק את הצפיפות עם קורא מקפרלנד.
אם הצפיפות היא פחות מ 1.0 מקפרלנד, להחזיר את הצינור שייקר דגירה יותר. אם הוא גדול מ- 1.0 מקפרלנד, הוסף מרק מולר-הינטון מותאם-יון לצינור, מערבולת בעדינות, ודגום מחדש עד ההשעיה היא ב 1.0 מקפרלנד. חשוב שהתרבות נמצאת בשלב הצמיחה הלוגאריתמית בעת הכנת האנקולום ההתחלתי.
אתה יכול לבנות עקומת צמיחה כדי לקבוע מתי אורגניזם מגיע לשלב זה. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ההשעיה של 1.0 מקפרלנד לצינורות 1 עד 4, ומערבולת אותם בעדינות. מיד לאחר ערבוב ובשעה אחת, שתיים, ארבע, שש ו -24 שעות, להסיר aliquot 150 מיקרוליטר מכל צינור תרבות על ידי הטיית הצינור, כך שרק קצה פיפטה סטרילי נכנס הצינור ולא פיר pipettor סטרילי במהלך נסיגת aliquot.
הוסף aliquots, בהתאמה, בארות רצופות בשורה הראשונה של צלחת 96 עמוק מוכן בעבר. מחזירים צינורות למדף מבחנה על שייקר באינקובטור אוויר אוויר סביבה של 35 מעלות צלזיוס מיד לאחר הסרת aliquots בכל נקודת זמן. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הסר 100 מיקרוליטרים משורה א' של הצלחת, והוסף אותה לשורה B, המכילה 900 מיקרוליטרים של מלוחים, ויוצרת דילול של 1 עד 10.
פיפטה הפתרון למעלה ולמטה ארבע עד חמש פעמים כדי לערבב, ולאחר מכן להשליך את הטיפים. ראשית, לתייג מולר-הינטון אגר צלחות עם תנאים אנטיביוטיים ודילול להיות מצופה. לאחר מכן, צלחת דגימות מדוללות עבור ספירת המושבה באמצעות שיטת צלחת טיפה, באמצעות פיפטה רב ערוצית עם טיפים ארוכים במיוחד.
הסר 10 microliters מכל באר בעמודה אחת, ולוותר בזהירות בשורה על הצלחת שכותרתו כראוי. המשך עד שכל השורות יחלקו על צלחות. בנוסף, בנקודת הזמן של 24 שעות, מניחים טיפה של 10 מיקרוליטר שנלקחה ישירות מצינור הבקרה השלילי למקום המוקדש לכך כדי לבדוק סטריליות.
לאחר מכן, להפוך את כל הצלחות, ו דגירה אותם לילה ב 35 מעלות צלזיוס באוויר הסביבה. לאחר מכן, ספור את מספר המושבות בכל אזור וחשב את צפיפות התאים. סמן מושבות עם סמן קבוע קצה דק על החלק ההפוך של הצלחת, כדי למנוע ספירה כפולה או מושבות חסרות.
עבור כל סדרת דילול, לזהות טיפות עם שלוש עד 30 מושבות. לספור את המושבות בטיפות אלה, ולתרשם את הספירה יחד עם גורם הדילול. מוצגת כאן רשת מניסוי סינרגיה של מערך דממה שבו minocycline בריכוזים של אפס עד 32 מיקרוגרם למיליליטר שולבו עם קוליסטין בריכוזים של אפס עד 16 מיקרוגרם למיליליטר ונבדק נגד זן של E.coli.
בארות עם ערכי OD600 מתחת ל- 07 אינן מייצגות צמיחה ומוצללים באדום, בעוד בארות עם ערכי OD600 מעל או שווה ל- 07 מייצגות צמיחה ומוצלות בירוק. עבור כל תרופה, הריכוז המעכב המינימלי הוא הריכוז הנמוך ביותר של תרופה המעכבת צמיחה חיידקית. עבור minocycline, זה 32 מיקרוגרם למיליליטר, ועל קוליסטין, זה שמונה מיקרוגרם למיליליטר.
הצללה נשמרת כאן, אבל ערכים בתוך בארות שבו הצמיחה מעוכבים מוחלפים על ידי ריכוז מעכבי שבר, או FIC, ערכי מדד. בכל באר, מדד FIC של כל תרופה מחושב על ידי חלוקת הריכוז של אנטיביוטיקה גם על ידי ריכוז מעכבות מינימלי של התרופה. בארות עם מדד FIC של פחות או שווה ל 0.5, אשר נחשב ניתוק לסינרגיה, מסומנים עם גבול קו שבור, ואת באר עם מדד FIC הנמוך ביותר מודגש.
מכיוון שערך ה- FIC המינימלי נמצא בטווח הסינרגטי, השילוב נחשב סינרגטי. דוגמה למקרה שאינו מדגים סינרגיה מוצגת כאן, כמו מדד FIC המינימלי שבו הצמיחה מעוכב הוא אחד, שהוא גדול מ 0.5. לבסוף, בדוגמה זו, התרחשו מספר בארות מדלגות, המייצגות צמיחה חיידקית מעוכב, למרות נוכחות של צמיחה חיידקית בארות סמוכות עם ריכוזים גבוהים יותר של אנטיביוטיקה.
אם יותר מאחד דילג היטב התרחש במערך לוח דמקת, יש למחוק את התוצאות ואת הבדיקה חוזרת על עצמה. דוגמה לגרף המדגים תוצאות של בדיקת סינרגיה של הרג בזמן מוצגת כאן. אנא עיינו בפרוטוקול הטקסט הנלווה לקבלת פרטים על פרשנות של תצהיס הסינרגיה של הרג הזמן.
מידע נוסף על הפעילות של שילובים סינרגטיים ניתן להשיג באמצעות הערכות של פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה באמצעות מחקרים vivo עם מודלים של בעלי חיים. בצע תמיד נהלי בטיחות מתאימים, כולל שימוש בציוד מגן אישי, בעת עבודה עם חיידקים. אם אתה יוצר אירוסולים או משתמש בפתוגנים בסיכון גבוה, בצע את כל העבודה בקבינט biosafety.
