وقد عزلت السكان الحقيقي من الخلايا الانعكاسية apoptotic مشكلة سابقا، مما يحد كثيرا من فهمنا على عواقب عكس المبرمج. هذا البروتوكول يسمح لنا لتوليد مجموعات أنقى من الخلايا الانعكاسية المبرمجة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المواد والمعدات المستخدمة متاحة على نطاق واسع في مؤسسة مختلفة.
هذه التقنية قابلة للتطبيق بسهولة لعزل مجموعات أنقى من الخلايا التي خضعت لعكس موت الخلايا المبرمج. كما ذكر سابقا، يمكن أن تذهب الخلايا الطبيعية أيضا الخضوع عكس المبرمج، أنه بصرف النظر عن خلايا سرطان الثدي، يمكن بدء الخلايا العلاجية الكيماوية المختلفة، وكذلك الخلايا الطبيعية، ومختلف المحفزات المبرمج. لأن الخلية عكس قد ذهبت من خلال المبرمج والفرز السريع، ومعدل الاسترداد عادة ما تكون منخفضة.
عدد خلية البدء أكبر هو إعادة الكومبينانت لزيادة العائد النهائي. للبدء، ثقافة MCF-7، MDA-MB-231، لبدء، ثقافة MCF-7، MDA-MB-231، والخلايا T47D، وفقا لبروتوكول النص. بعد هذا، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، ثم إضافة ملليلتر اثنين من 0.05 في المئة التربسين-EDTA من 0.05 في المئة التربسين-EDTA إلى MCF-7، والخلايا MDA-MB-231، إلى MCF-7، والخلايا MDA-MB-231، ومليلترين من 0.25 في المئة التربسين-EDTA ومليلترين من 0.25 بالمائة التربسين-EDTA إلى الخلايا T47D.
إلى خلايا T47D. ثقافة الخلايا لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية، في حاضنة ثقافة خلية ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة. في حين أن الخلايا تحتضن ، تحقق من انفصال الخلايا باستخدام المجهر لمنع الإفراط في الهضم عن طريق التربسين -EDTA.
عندما أكثر من 90 في المئة من الخلايا فصل، إضافة خمسة ملليلتر من متوسطة RPMI الانتهاء إلى الطبق، والماصة على سطح طبقة الخلية عدة مرات. ثم، نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر، والطرد المركزي. تخلص من المُتطَاَر، ثمّ اُعيد تعليق الكريات بمخزن FACS في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الصغرى 1.5 ملليلتر.
ثم، تقسيم الخلايا إلى أنابيب عدة. الطرد المركزي الأنابيب مرة أخرى، والتخلص من الفائق. ثم، إضافة كتلة Fc المخففة إلى العينات.
احتضان العينات على الجليد في الظلام لمدة 20 دقيقة، قبل الطرد المركزي للعينات مرة أخرى. بعد هذا، تجاهل المابير. بعد ذلك، إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة الفلوروكرومية المترافقة ضد CD44 الإنسان، وD24، ضد CD44 الإنسان، وD24، في واحد إلى 40، واحد إلى 10 المخففات، على التوالي، إلى المجموعات المزدوجة التلوين.
للضوابط الإيجابية، إضافة الأجسام المضادة CD44 للضوابط الإيجابية، إضافة الأجسام المضادة CD44 إلى خلايا MDA-MB-231، إلى خلايا MDA-MB-231، وCD24 الأجسام المضادة لخلايا MCF-7 والأجسام المضادة لCD24 إلى الخلايا MCF-7 في واحد إلى 40، واحد إلى 10 التخفيفات، على التوالي. أضف PerCP-Cy5.5 ماوس IgG2b كابا، أضف PerCP-Cy5.5 ماوس IgG2b كابا، مخفف بنسبة 1 إلى 40 إلى الخلايا كتحكم نظيري للأجسام المضادة CD44. ثم، إضافة PE ماوس IgG2a كابا، ثم، إضافة PE ماوس IgG2a كابا، المخفف في نسبة واحد إلى 10 إلى الخلايا كتحكم النظائر للأجسام المضادة CD24.
احتضان العينات في أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. ثم، الطرد المركزي العينات في 300 ز ثم، الطرد المركزي العينات في 300 غرام و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير، وغسل بيليه مرتين في 500 ميكرو ليتر من برنامج تلفزيوني.
ثم، كرر الطرد المركزي كما هو موضح سابقا. إعادة تعليق بيليه على 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني، وتصفية التعليق من خلال شبكة النايلون 40 ميكرومتر. ثم، تشغيل التعليق من خلال فارز خلية مُنشّط بالفلوريسنس.
جمع الخلايا مع CD44 السلبية، وعلامات إيجابية CD24 في أنابيب مستديرة القاع التي تحتوي على ملليلتر واحد من متوسط جمع. ثم، الطرد المركزي الأنابيب، والتخلص من الفائق. المقبل، لوحة خلايا سرطان الثدي غير الجذعية فرزها في طبق ثقافة تحتوي على وسيلة جمع جديدة لمزيد من الثقافة.
أولاً، استخدمي واحدة من المليمولار ستاروسبورين في DMSO، لإعداد 2.5 أضراس صغيرة ستوروسبورين في الوسط، وفقًا لبروتوكول النص. ثم قم بإزالة الوسيطة الثقافة من الخلايا. غسل الخلايا مع مليلترين من برنامج تلفزيوني مرة واحدة، بعد هذا، إضافة 10 ملليلتر من وسط الستوروسبورين إلى خلايا منظمة أطباء بلا حدود-7 لمدة ست ساعات، للحث على المبرمج، عندما تكون الخلايا 70 في المئة التقاء.
المقبل, إعداد باكليتاكسيل مليمولار واحد في DMSO. ثم، إضافة 12.5 ميكرو ليتر ثم، إضافة 12.5 ميكرو ليتر من باكليتاكسيل 1 ملليمولار إلى المتوسطة المكتملة من الخلايا T47D لتعويض حجم النهائي من 10 ملليلتر في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إزالة المتوسطة الثقافة من الخلايا، وغسل الخلايا مع 2 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
ثم، إضافة وسط باكليتاكسيل إلى الخلايا لمدة 10 ساعات للحث على موت الخلايا المبرمج لمدة 10 ساعات للحث على موت الخلايا عندما تصل الخلايا إلى 70 في المئة التقاء. بعد ذلك، قم بإزالة الوسيط من مجموعة MCF-7 المعالجة بالمذيبات، واغسلها بمليلترين من PBS. ثم، إضافة 10 ملليلتر من 0.25 في المئة DMSO المتوسطة ثم، إضافة 10 ملليلتر من 0.25 في المئة DMSO المتوسطة لمدة ست ساعات كتحكم المذيبات لstaurosporine.
إزالة المتوسطة الثقافة من مجموعة T47D المعالجة بالمذيبات، وغسل الخلايا مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة 10 ملليلتر من 0.05 في المئة DMSO المتوسطة ثم، إضافة 10 ملليلتر من 0.05 في المئة DMSO المتوسطة لمدة 10 ساعات كتحكم المذيبات لباكليتاكسيل. بعد ذلك، وصمة عار الخلية واحتضانها لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 في المئة ثاني أكسيد الكربون.
استخدم 60 مرة مجهر مسح الليزر لمراقبة التغيرات المورفولوجية للخلايا المعالجة. وصمة عار على حد سواء محرض المبرمج والمذيبات المعالجة MCF-7 وخلايا T47D والخلايا MCF-7 و T47D المعالجة بالمذيبات في الظلام لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة. باستخدام فارز الخلية المنشط بالفلور، قم بجمع الخلايا الإيجابية من المجموعات المعالجة بالمحفز في أنابيب قاعية مستديرة تحتوي على ملليلتر واحد من متوسطة الجمع.
ثم، الطرد المركزي الأنابيب كما وصفت سابقا، والتخلص من الفائق. جمع الخلايا السلبية من المجموعات المذيبات المعالجة في أنابيب مستديرة القاع مع ملليلتر واحد من وسط جمع. الطرد المركزي الأنابيب، والتخلص من فائقة.
بعد ذلك، re-suspend الخلايا فرز في مجموعة جديدة المتوسطة. بذور الخلايا في 12-جيدا لوحات ثقافة الأنسجة، وثقافتها لمدة سبعة أيام لعكس موت الخلايا المبرمج. حصاد MCF-7 عكس في كل من محفز ومجموعات المعالجة بالمذيبات مع 0.05 في المئة التربسين-EDTA.
مع 0.05 في المئة التربسين-EDTA. ثم، حصاد الخلايا T47D في كل من محفز ثم، حصاد الخلايا T47D في كل من المجموعات المستحث والمذيبات المعالجة مع 0.25 في المئة التربسين-EDTA. وصمة عار الخلايا مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة fluorochrome-مترافق ضد CD44 الإنسان وD24.
أثناء وصمة عار الخلايا، إعداد عناصر تحكم isotype كما هو موضح سابقا. وأخيرا، تشغيل الخلايا على جهاز قياس تدفق، والكشف عن النسبة المئوية للخلايا مع CD44 إيجابية، وD24 علامات سلبية. في هذا البروتوكول، لوحظ الانتقال من خلايا سرطان الثدي غير الجذعية إلى خلايا تشبه سي.
تم عزل الخلايا السرطانية غير الجذعية لأول مرة في خلايا MCF-7. لوحظت تغيرات شكلية نموذجية بعد إضافة محرضات المبرمجين ، والخلايا التي تم استردادها من موت الخلايا المبرمج مع مورفولوجيا مماثلة بعد انسحاب المخدرات. تم تسمية الخلايا المنشطة caspace وفرزها على أساس كثافة الفلوريسنس أعلى من الخلايا دون تنشيط الزه.
أثناء عملية التعريفي المبرمج، واستخدمت المذيبات لاستبعاد إمكانية أن الإجراء الحقائق، أو المذيب نفسه، كان السبب في الانتقال. تم العثور على الخلايا المنشطة في مجموعات العلاج محرض مصاصة في الدم أن يكون ني شين خمسة إيجابية وPI السلبية، مما يشير إلى أنها كانت الخلايا المبرمج. تم جمع الخلايا المبرمجة واستزراعها للتعافي، بالمقارنة مع المجموعات المعالجة بالمذيبات، أظهر تحليل التدفق الخلوي أن هناك خلايا تظهر في الربع السلبي CD44 الإيجابي وD24 في خلايا سرطان الثدي المعكوسة في الأصل.
هفوة مهم في تحليل التدفق وفرز الخلايا، أن السيطرة الكافية ينبغي أن تكون مستعدة في المختبرات. منذ هذا في المختبر تخثر الدم في إجراء يعزل الخلايا السرطانية المبرمج نقية, تجارب مثل في أصول ورمigenesis الجسم الحي يمكن إجراء لفهم عواقب عكس الخلايا الحقيقية. هذه التقنية تلقي الضوء على سبب الانتكاس السرطان، وبالتالي، فإنه يمكن التحقيق فيها لمنع احتمال حدوث مرة أخرى في مرضى السرطان.
يرجى تذكر لحماية نفسك بشكل صحيح عند إجراء تجارب ثقافة الخلية وفقا للوائح الطبقة السلامة البيولوجية في مؤسستك.
