Die Isolierung enthoben erpopulationen von apoptotischen Umkehrzellen war bisher ein Problem, das unser Verständnis über die Folgen der Apoptose-Umkehr stark einschränkt. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, eine reinere Populationen von apoptotischen Umkehrzellen zu erzeugen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die verwendeten Materialien und Ausrüstungen in verschiedenen Institutionen weit verbreitet sind.
Diese Technik ist leicht anwendbar für die Isolierung einer reineren Populationen von Zellen, die eine Umkehrung der Apoptose durchgemacht haben. Wie bereits berichtet, können normale Zellen auch apoptose umkehren, dass neben Brustkrebszellen auch verschiedene Chemozellen sowie normale Zellen gestartet und die verschiedenen apoptotischen Reize verwendet werden können. Da die Umkehrzelle durch Apoptose und schnelle Sortierung gegangen ist, ist die Wiederherstellungsrate in der Regel niedrig.
Eine größere Startzellenzahl ist rekombinant, um die Endausbeute zu erhöhen. Zu Beginn, Kultur MCF-7, MDA-MB-231, Zu beginn, Kultur MCF-7, MDA-MB-231 und T47D-Zellen, nach dem Textprotokoll. Danach die Zellen zweimal mit PBS waschen und dann zwei Milliliter 0,05 Prozent Trypsin-EDTA von 0,05 Prozent Trypsin-EDTA in den MCF-7, und MDA-MB-231-Zellen, zu den Zellen MCF-7 und MDA-MB-231 sowie zwei Milliliter 0,25 Prozent Trypsin-EDTA und zwei Milliliter von 0,25 Prozent Trypsin-EDTA an die T47D-Zellen.
t47D-Zellen. Kultur die Zellen für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, in einem fünf Prozent Kohlenstoff-Dioxid-Zellkultur-Inkubator. Während die Zellen brüten, überprüfen Sie die Ablösung der Zellen mit einem Mikroskop, um eine Überverdauung durch Trypsin-EDTA zu verhindern.
Wenn sich mehr als 90 Prozent der Zellen lösen, fügen Sie der Schale fünf Milliliter abgeschlossenes RPMI-Medium hinzu und pipetteten Sie es mehrmals über die Zellschichtoberfläche. Dann übertragen Sie die Zellen in 15 Milliliter konische Röhren und Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie die Pellets mit FACS-Puffer in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohren wieder auf.
Dann teilen Sie die Zellen in mehrere Röhren. Zentrifugieren Sie die Rohre noch einmal und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie dann den Proben einen verdünnten Fc-Block hinzu.
Die Proben im Dunkeln 20 Minuten auf Eis bebrüten, bevor die Proben wieder zentrifugiert werden. Danach entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie fluorchromekonjugierte monoklonale Antikörper gegen menschliche CD44 und CD24 gegen menschliche CD44 und CD24 in ein bis 40 bzw. ein bis zehn Verdünnungen zu den Doppelfärbungsgruppen hinzu.
Für die positiven Kontrollen fügen Sie CD44-Antikörper Hinzu Für die positiven Steuerelemente CD44-Antikörper zu den MDA-MB-231-Zellen, zu den MDA-MB-231-Zellen und CD24-Antikörpern zu den MCF-7-Zellen und CD24-Antikörpern zu den MCF-7-Zellen in ein bis 40 bzw. ein bis zehn Verdünnungen hinzu. PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Add PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa hinzufügen, verdünnt im Verhältnis eins bis 40 zu Zellen als Isotopensteuerung für CD44-Antikörper. Dann fügen Sie PE Mouse IgG2a Kappa, Dann, fügen Sie PE Maus IgG2a Kappa, verdünnt in einem Verhältnis von eins bis 10 zu den Zellen als Isotopensteuerung für CD24 Antikörper.
Die Proben bei vier Grad Celsius im Dunkeln 30 Minuten lang bebrüten. Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g es Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 300 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zweimal in 500 Mikroliter PBS.
Wiederholen Sie dann die Zentrifugation wie zuvor beschrieben. Setzen Sie das Pellet auf 0,5 Milliliter PBS wieder auf und filtern Sie die Suspension durch ein 40 Mikrometer Nylongewebe. Führen Sie dann die Suspension durch einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer aus.
Sammeln Sie die Zellen mit CD44-Negativ und CD24-positiven Markern in rund-bodenigen Röhren, die ein Milliliter Sammelmedium enthalten. Zentrifugieren Sie dann die Rohre und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes die sortierten Brust-Nicht-Stammkrebszellen in einem Kulturgericht mit frischem Sammelmedium für weitere Kultur aufzuführen.
Verwenden Sie zunächst ein Millimolar-Staurosporin in DMSO, Um 2,5 Mikromolaren Staurosporin in Medium vorzubereiten, gemäß dem Textprotokoll. Entfernen Sie dann das Kulturmedium aus den Zellen. Waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS einmal, danach fügen Sie 10 Milliliter des Staurosporinmediums zu den MSF-7-Zellen für sechs Stunden hinzu, um Apoptose zu induzieren, wenn die Zellen zu 70 Prozent konfluent sind.
Als nächstes bereiten Sie ein Millimolar-Paclitaxel in DMSO vor. Dann fügen Sie 12,5 Mikroliter dann 12,5 Mikroliter des 1 Millimolaren Paclitaxel s auf das fertige Medium der T47D-Zellen, um ein endgültiges Volumen von 10 Milliliter in einem 15 Milliliter konischen Rohr zu machen. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen, und waschen Sie die Zellen mit 2 MilliliterPBS.
Dann fügen Sie das Paclitaxel-Medium für 10 Stunden in die Zellen, um Apoptose für 10 Stunden zu induzieren, um Apoptose zu induzieren, wenn die Zellen 70 Prozent Konfluenz erreichen. Danach das Medium aus der lösungsmittelbehandelten MCF-7-Gruppe entfernen und mit zwei Millilitern PBS waschen. Dann fügen Sie 10 Milliliter von 0,25 Prozent DMSO Medium dann, fügen Sie 10 Milliliter 0,25 Prozent DMSO Medium für sechs Stunden als Lösungsmittelkontrolle für Staurosporin.
Entfernen Sie das Kulturmedium aus der lösungsmittelbehandelten T47D-Gruppe, und waschen Sie die Zellen mit zwei MilliliterPBS. Dann fügen Sie 10 Milliliter von 0,05 Prozent DMSO Medium dann 10 Milliliter 0,05 Prozent DMSO Medium für 10 Stunden als Lösungsmittelkontrolle für Paclitaxel hinzufügen. Als nächstes färben Sie die Zelle und bebrüten sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxyd-Inkubator.
Verwenden Sie ein 60-fach konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, um die morphologischen Veränderungen der behandelten Zellen zu beobachten. Stain sowohl die apoptotischen Induktoren und lösungsmittelbehandelten MCF-7- und T47D-Zellen und lösungsmittelbehandelten MCF-7- und T47D-Zellen im Dunkeln für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent Kohlendioxyd-Inkubator. Sammeln Sie mit dem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer die positiven Zellen aus den mit Induktorbehandelten Induktionsgruppen in runden Bodenröhrchen, die ein Milliliter Sammelmedium enthalten.
Zentrifugieren Sie dann die Rohre wie zuvor beschrieben, und entsorgen Sie den Überstand. Sammeln Sie die negativen Zellen aus den lösungsmittelbehandelten Gruppen in rund-Boden-Röhren mit einem Milliliter Sammelmedium. Zentrifugieren Sie die Rohre und entsorgen Sie den Überstand.
Danach setzen Sie die sortierten Zellen in einem neuen Sammelmedium erneut aus. Säen Sie die Zellen in 12-Well-Gewebekulturplatten, und kulture sie für sieben Tage für Apoptose-Umkehr. Ernten Sie den umgekehrten MCF-7 sowohl in Induktor- als auch in lösungsmittelbehandelten Gruppen mit 0,05 Prozent Trypsin-EDTA.
0,05 Prozent Trypsin-EDTA. Dann ernten Sie die T47D-Zellen in beiden Induktor dann, Ernten Sie die T47D-Zellen in beiden Induktor- und lösungsmittelbehandelten Gruppen mit 0,25 Prozent Trypsin-EDTA. Stain die Zellen mit fluorchrome-konjugierten monoklonalen Antikörpern gegen menschliche CD44 und CD24.
Während die Zellen färben, bereiten Sie die Isotypkontrollen vor, wie zuvor gezeigt. Führen Sie schließlich die Zellen auf einem Durchflusszytometer aus, und erkennen Sie den Prozentsatz der Zellen mit CD44-positiven und CD24-negativen Markern. In diesem Protokoll wurde der Übergang von Brust-Nicht-Stammkrebszellen zu Brust-CSC-ähnlichen Zellen beobachtet.
Die Isolierung von Nicht-Stammzellen wurde zuerst in MCF-7-Zellen durchgeführt. Typische morphologische Veränderungen wurden nach Zugabe von apoptotischen Induktoren beobachtet, und die Zellen erholten sich von Apoptose mit ähnlicher Morphologie nach dem Drogenentzug. Die kavraumaktivierten Zellen wurden aufgrund ihrer höheren Fluoreszenseintensität beschriftet und aussortiert als Zellen ohne Kavalleumaktivierung.
Während des apoptotischen Induktionsprozesses wurde Lösungsmittel verwendet, um die Möglichkeit auszuschließen, dass das Faktenverfahren oder das Lösungsmittel selbst die Ursache für den Übergang war. Caspace-aktivierte Zellen in den apoptotisch-induzierenden Behandlungsgruppen wurden als nexin fünf positive und PI-negative, was darauf hindeutet, dass sie apoptotische Zellen waren. Die apoptotischen Zellen wurden gesammelt und zur Erholung kultiviert, verglichen mit den lösungsmittelbehandelten Gruppen zeigte die zytometrische Flussanalyse, dass im CD44-positiven und CD24-negativen Quadranten in der umgekehrten ursprünglich nicht-Stammkrebszellpopulation die Zelle cd44 und CD24 auftraten.
Gaging ist wichtig in der Strömungsanalyse und Zellsortierung, dass eine ausreichende Kontrolle in den Labors vorbereitet werden sollte. Da dieses In-vitro-Apoptose-Umkehrverfahren reine apoptotische Krebszellen isoliert, können Experimente wie in vivo-Tumorgenese-Assets durchgeführt werden, um die Folgen einer realen Umkehr der Zellen zu verstehen. Diese Technik beleuchtet die Ursache für Krebsrückfälle, daher kann es untersucht werden, um das Wiederauftreten bei Krebspatienten zu verhindern.
Bitte denken Sie daran, sich bei der Durchführung von Zellkulturexperimenten gemäß den Biosafe-Tier-Vorschriften in Ihrer Einrichtung richtig zu schützen.
