Изоляция подлинных популяций апоптотических реверсивных клеток была проблемой ранее, что значительно ограничивает наше понимание последствий разворота апоптоза. Этот протокол позволяет нам генерировать более чище популяций апоптотических разворотных клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что используемые материалы и оборудование широко доступны в различных учреждениях.
Этот метод легко применим для изоляции более чище популяций клеток, которые подверглись развороту апоптоза. Как сообщалось ранее, нормальные клетки могут также пройти апоптоз разворота, что помимо раковых клеток молочной железы, различные клетки химиотерапии, а также нормальные клетки, могут быть начаты и различные апоптотические стимулы могут быть использованы. Потому что реверсивная клетка прошла через апоптоз и быструю сортировку, скорость восстановления, как правило, низкая.
Большее исходное число клеток рекомбинантно, чтобы увеличить конечный выход. Для начала, культура MCF-7, MDA-MB-231, Для начала, культура MCF-7, MDA-MB-231, и T47D клеток, в соответствии с текстовым протоколом. После этого, мыть клетки с PBS в два раза, а затем добавить два миллилитров 0,05 процента трипсина-ЭДТА 0,05 процента трипсина-ЭДТА в MCF-7, и клетки MDA-MB-231, к клеткам MCF-7 и MDA-MB-231, и два миллилитра 0,25 процента трипсина-ЭДТА и два миллилитра 0,25 процента трипсина-ЭДТА к клеткам T47D.
в ячейки T47D. Культура клеток в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию, в пять процентов углекислого газа культуры инкубатора. В то время как клетки инкубируются, проверьте отслоение клеток с помощью микроскопа, чтобы предотвратить чрезмерное переваривание трипсином-ЭДТА.
Когда более 90 процентов клеток отсоединиться, добавить пять миллилитров завершенных RPMI среды блюдо, и пипетки его над поверхностью слоя клетки несколько раз. Затем перенесите клетки на 15 миллилитров конических трубок и центрифуг. Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте гранулы буфером FACS в 1,5 миллилитровых микро-центрифугах.
Затем разделите клетки на несколько трубок. Центрифуга трубки еще раз, и отказаться от супернатанта. Затем добавьте разбавленный блок Fc в образцы.
Инкубировать образцы на льду в темноте в течение 20 минут, прежде чем центрифугировать образцы снова. После этого отбросьте супернатант. Далее добавьте моноклональные антитела против человеческого CD44 и CD24 против человеческого CD44 и CD24 в отношении человеческих CD44 и CD24 в один-40 и от одного до 10 разбавлений, соответственно, к группам двойного окрашивания.
Для положительного контроля, добавить CD44 антитела Для положительных элементов управления, добавить CD44 антитела к клеткам MDA-MB-231, к клеткам MDA-MB-231, и CD24 антитела к клеткам MCF-7 и CD24 антитела к клеткам MCF-7 в одном к 40, и от одного до 10 разбавления, соответственно. Добавить PerCP-Cy5.5 Мышь IgG2b Каппа, Добавить PerCP-Cy5.5 Мышь IgG2b Каппа, разбавленный на один к 40 отношение к клеткам в качестве контроля изотопов для CD44 антител. Затем добавьте PE Mouse IgG2a Kappa, затем добавьте PE Mouse IgG2a Kappa, разбавленный при соотношении 1 к 10 к клеткам в качестве изотопного контроля антител CD24.
Инкубировать образцы при четырех градусах по Цельсию в темноте в течение 30 минут. Затем центрифуга образцов на 300 г Затем, центрифуга образцов на 300 г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и дважды помойте гранулы в 500 микролитров PBS.
Затем повторите центрифугу, как описано ранее. Повторно приостанавливайте гранулы на 0,5 миллилитров PBS и фильтруйте подвеску через 40-метровую нейлоновую сетку. Затем запустите подвеску через флуоресценцию активированного сортера клеток.
Соберите клетки с отрицательным CD44 и положительными маркерами CD24 в трубах с круглым дном, содержащих один миллилитр среды сбора. Затем центрифуга труб, и отказаться от супернатанта. Далее, пластины отсортированы груди, не стволовых раковых клеток в культуре блюдо, содержащее свежие среды сбора для дальнейшей культуры.
Во-первых, используйте один миллимолярн стауроспорин в DMSO, чтобы подготовить 2,5 микро-моляров стауроспорина в среде, в соответствии с текстовым протоколом. Затем удалите культурную среду из клеток. Вымойте клетки с двумя миллилитров PBS один раз, после этого, добавить 10 миллилитров стауроспорина среды в клетки MSF-7 в течение шести часов, чтобы вызвать апоптоз, когда клетки 70 процентов слияния.
Далее приготовьте один миллимолярдный паклитаксел в DMSO. Затем добавьте 12,5 микролитров Затем добавьте 12,5 микролитров 1 миллимолярный паклитаксел к завершенной среде клеток T47D, чтобы составить окончательный объем 10 миллилитров в 15 миллилитровой конической трубке. Удалить культурную среду из клеток, и мыть клетки с 2 миллилитров PBS.
Затем добавьте paclitaxel среды к клеткам в течение 10 часов, чтобы вызвать апоптоз в течение 10 часов, чтобы вызвать апоптоз, когда клетки достигают 70 процентов слияния. После этого, удалить среду из растворителя обработанных MCF-7 группы, и мыть их с двумя миллилитров PBS. Затем добавьте 10 миллилитров 0,25 процента DMSO среднего Затем, добавить 10 миллилитров 0,25 процента DMSO среды в течение шести часов в качестве растворителя для staurosporine.
Удалите культурную среду из обработанной растворителем группы T47D и промыте клетки двумя миллилитров PBS. Затем добавьте 10 миллилитров 0,05 процента DMSO среднего Затем, добавить 10 миллилитров 0,05 процента DMSO среды в течение 10 часов в качестве растворителя управления для paclitaxel. Затем испачкайте клетку и инкубировать их в течение 20 минут при 37 градусах по Цельсию в пятипроцентной инкубаторе с углекислым газом.
Используйте 60-х раз конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп для наблюдения за морфологическими изменениями обработанных клеток. Пятно как апоптотический индуктор и растворитель обработанных MCF-7 и T47D клеток и растворителя обработанных MCF-7 и T47D клеток в темноте в течение 30 минут при 37 градусов по Цельсию в пять процентов углекислого газа инкубатора. Используя флуоресценцию активированный сортатор клеток, соберите положительные клетки из групп, обработанных индуктором, в круглых нижних трубках, содержащих один миллилитр среды сбора.
Затем центрифуга труб, как описано ранее, и отбросить супернатант. Соберите отрицательные клетки из обработанных растворителем групп в трубах с круглым дном с одним миллилитром среды сбора. Центрифуга труб, и отказаться от супернатанта.
После этого повторно приостанавливаем отсортированную ячейку в свежей среде сбора. Семя клеток в 12-хорошо пластин культуры ткани, и культуры их в течение семи дней для разворота апоптоза. Урожай обратный MCF-7 как в индуктор и растворителя обработанных групп с 0,05 процента трипсина-EDTA.
с 0,05 процента трипсина-ЭДТА. Затем, урожай T47D клеток в обоих индуктор затем, урожай T47D клеток в обоих индукторных и растворителя обработанных групп с 0,25 процента трипсина-ЭДТА. Пятно клеток с фторхром-конъюгированных моноклональных антител против человека CD44 и CD24.
В то время как клетки пятна, подготовить изотип управления, как это было ранее продемонстрировано. Наконец, запустить клетки на поток цитометра, и обнаружить процент клеток с CD44 положительные, и CD24 отрицательных маркеров. В этом протоколе наблюдался переход от раковых клеток молочной железы, не являя стволовыми, к клеткам, похожим на груди.
Изоляция не-стволовых раковых клеток была впервые сделана в клетках MCF-7. Типичные морфологические изменения наблюдались после добавления апоптотических индукторов, и клетки оправились от апоптоза с аналогичной морфологией после отмены препарата. Клетки, активированные в космосе, были помечены и отсортированы на основе их интенсивности с более высоким флуоресценсе, чем клетки без активации цейспейна.
В процессе апоптотической индукции растворитель использовался для исключения возможности того, что причиной перехода стала процедура фактов или сам растворитель. Caspace активированных клеток в апоптотических индукторов групп лечения было установлено, что nexin пять положительных и PI отрицательным, предполагая, что они были апоптотических клеток. Апоптотические клетки были собраны и культурны для восстановления, по сравнению с растворителем обработанных групп, поток цитометрического анализа показали, что были клетки, появляющиеся в CD44 положительный и CD24 отрицательный квадрант в обратном первоначально груди, не стволовых раковых клеток населения.
Gaging имеет важное значение в анализе потока и сортировки клеток, что достаточный контроль должен быть подготовлен в лабораториях. Так как эта процедура разворота апоптоза in vitro изолирует чистые апоптотические раковые клетки, можно проводить эксперименты, такие как активы in vivo tumorigenesis, чтобы понять последствия реального обратного изменения клеток. Этот метод проливает свет на причину рецидива рака, поэтому, он может быть исследован, чтобы потенциально предотвратить повторное возникновение у больных раком.
Пожалуйста, не забудьте защитить себя должным образом при проведении экспериментов клеточной культуры в соответствии с правилами биобезопасного уровня в вашем учреждении.
