Os isolamentos de populações genuínas de células de reversão apoptótica tem sido um problema anteriormente, o que limita muito nossa compreensão sobre as consequências da reversão da apoptose. Este protocolo nos permite gerar populações mais puras de células de reversão apoptótica. A principal vantagem dessa técnica é que os materiais e equipamentos utilizados estão amplamente disponíveis em diferentes instituições.
Esta técnica é prontamente aplicável para isolar uma população mais pura de células que sofreram reversão da apoptose. Como relatado anteriormente, as células normais também podem passar por reversão da apoptose, que além das células cancerígenas de mama, diferentes células de quimioterapia, bem como células normais, podem ser iniciadas e os vários estímulos apoptóticos podem ser usados. Como a célula de reversão passou por apoptose e triagem rápida, a taxa de recuperação geralmente é baixa.
Um número de célula inicial maior é recombinante para aumentar o rendimento final. Para começar, cultura MCF-7, MDA-MB-231, Para começar, cultura MCF-7, MDA-MB-231 e células T47D, de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, lave as células com PBS duas vezes, depois adicione dois mililitros de 0,05% trypsin-EDTA de 0,05% trypsin-EDTA ao MCF-7, e células MDA-MB-231, para as células MCF-7 e MDA-MB-231, e dois mililitros de 0,25% trypsin-EDTA e dois mililitros de 0,25% trypsin-EDTA para as células T47D.
para as células T47D. Cultue as células por cinco minutos a 37 graus Celsius, em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de 5%. Enquanto as células incubam, verifique o desprendimento das células com um microscópio para evitar a super digestão por trippsina-EDTA.
Quando mais de 90% das células se desprenderem, adicione cinco mililitros de meio RPMI completo ao prato, e pipeta-o sobre a superfície da camada celular várias vezes. Em seguida, transfira as células para tubos cônicos de 15 mililitros e centrífuga. Descarte o supernatante e suspenda as pelotas com tampão FACS em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitro.
Em seguida, divida as células em vários tubos. Centrifugar os tubos mais uma vez, e descartar o supernatante. Em seguida, adicione bloco fc diluído às amostras.
Incubar as amostras no gelo no escuro por 20 minutos, antes de centrifugar as amostras novamente. Depois disso, descarte o supernaspe. Em seguida, adicione anticorpos monoclonais fluorocromáticos conjugados contra CD44 humanos, cd24, contra CD44 humano, e CD24, em um a 40, e de uma a 10 diluições, respectivamente, aos grupos de coloração dupla.
Para os controles positivos, adicione anticorpos CD44 Para os controles positivos, adicione anticorpos CD44 às células MDA-MB-231, às células MDA-MB-231 e anticorpos CD24 às células MCF-7 e anticorpos CD24 às células MCF-7 em uma a 40, e de um a 10 diluições, respectivamente. Adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Adicionar PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, diluído a uma proporção de um a 40 para células como um controle de isótopos para anticorpos CD44. Em seguida, adicione PE Mouse IgG2a Kappa, Em seguida, adicione PE Mouse IgG2a Kappa, diluído em uma proporção de um a 10 para as células como um controle de isótopos para anticorpos CD24.
Incubar as amostras a 4 graus Celsius no escuro por 30 minutos. Em seguida, centrifugar as amostras a 300 g's Then, centrifugar as amostras a 300 g's e quatro graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernascer e lave a pelota duas vezes em 500 micro litros de PBS.
Em seguida, repita a centrifugação como descrito anteriormente. Suspenda a pelota em 0,5 mililitros de PBS e filtre a suspensão através de uma malha de nylon de 40 micrômetros. Em seguida, execute a suspensão através de um classificador celular ativado por fluorescência.
Colete as células com marcadores negativos CD44 e CD24 positivos em tubos de fundo redondo contendo um mililitro de meio de coleta. Em seguida, centrifugar os tubos, e descartar o supernasal. Em seguida, emplaque as células cancerígenas de mama classificadas em um prato de cultura contendo meio de coleta fresco para mais cultura.
Primeiro, use uma staurosporina milimila em DMSO, para preparar 2,5 micro-molares de staurosporina em médio, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, remova o meio de cultura das células. Lave as células com dois mililitros de PBS uma vez, depois disso, adicione 10 mililitros do meio de estaurosporina às células MSF-7 por seis horas, para induzir apoptose, quando as células são 70% confluentes.
Em seguida, prepare um paclitaxel milimão no DMSO. Em seguida, adicione 12,5 micro litros Em seguida, adicione 12,5 micro litros do paclitaxel de 1 milimolar ao meio completo das células T47D para compor um volume final de 10 mililitros em um tubo cônico de 15 mililitros. Remova o meio de cultura das células e lave as células com 2 mililitros de PBS.
Em seguida, adicione o meio paclitaxel às células por 10 horas para induzir apoptose por 10 horas para induzir apoptose quando as células atingirem 70% de confluência. Depois disso, remova o meio do grupo MCF-7 tratado com solventes e lave-os com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,25% de média DMSO Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,25% de média DMSO por seis horas como o controle de solvente para staurosporina.
Remova o meio de cultura do grupo T47D tratado com solventes e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,05% de meio DMSO Em seguida, adicione 10 mililitros de 0,05% de média DMSO por 10 horas como o controle de solvente para paclitaxel. Em seguida, manche a célula e incuba-as por 20 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%.
Use um microscópio de varredura a laser confocal 60 vezes para observar as alterações morfológicas das células tratadas. Colora as células MCF-7 e T47D tratadas com solventes e as células MCF-7 e T47D tratadas com solventes no escuro por 30 minutos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5%. Utilizando o classificador celular ativado pela fluorescência, colete as células positivas dos grupos tratados com indutores em tubos de fundo redondo contendo um mililitro de meio de coleta.
Em seguida, centrifugar os tubos como descrito anteriormente, e descartar o supernatante. Colete as células negativas dos grupos tratados com solventes em tubos de fundo redondo com um mililitro de meio de coleta. Centrifugar os tubos, e descartar o supernaspeso.
Depois disso, suspenda as células classificadas em meio de coleta fresca. Semear as células em placas de cultura tecidual de 12 poços, e cultuá-las por sete dias para reversão da apoptose. Colher o MCF-7 invertido em grupos indutores e tratados com solventes com 0,05% de trypsin-EDTA.
com 0,05% de trypsin-EDTA. Em seguida, colher as células T47D em ambos os indutores, em seguida, colher as células T47D em grupos indutores e tratados com solventes com 0,25% de trypsin-EDTA. Manche as células com anticorpos monoclonais conjugados fluorocromáticos contra CD44 humanos e CD24.
Enquanto as células mancham, prepare os controles do isótipo como demonstrado anteriormente. Finalmente, execute as células em um citômetro de fluxo e detecte a porcentagem de células com marcadores negativos CD44 e CD24 negativos. Neste protocolo, observou-se a transição de células cancerígenas não-tronco de mama para células semelhantes a CSC de mama.
O isolamento de células cancerígenas não-tronco foi feito pela primeira vez em células MCF-7. Alterações morfológicas típicas foram observadas após a adição de indutores apoptóticos, e as células recuperadas da apoptose com morfologia semelhante após a retirada de medicamentos. As células ativadas pelo caspace foram rotuladas e classificadas com base em sua maior intensidade fluorescense do que as células sem ativação do caspace.
Durante o processo de indução apoptótica, o solvente foi utilizado para excluir a possibilidade de que o procedimento dos fatos, ou o próprio solvente, fosse a causa da transição. Células ativadas pelo caspace nos grupos de tratamento apoptótico-indutor foram encontradas como sendo um nexin cinco positivo e pi negativo, sugerindo que eram células apoptóticas. As células apoptóticas foram coletadas e cultivadas para recuperação, em comparação com os grupos tratados com solventes, a análise citométrica do fluxo mostrou que havia células aparecendo no quadrante negativo CD44 e CD24 na população inversa originalmente de células cancerígenas não-tronco de mama.
A mordaça é importante na análise de fluxo e na triagem celular, que o controle suficiente deve ser preparado nos laboratórios. Uma vez que esse procedimento de reversão in vitro da apoptose isola células cancerígenas puras apoptóticas, experimentos como ativos in vivo tumorigênese podem ser realizados para entender as consequências do real reverso das células. Essa técnica esclarece a causa da recaída do câncer, portanto, pode ser investigada para potencialmente prevenir a recorrência em pacientes com câncer.
Por favor, lembre-se de se proteger adequadamente ao realizar experimentos de cultura celular de acordo com as regulamentações de nível biossegurança em sua instituição.
