يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التهابات الحيوية حول التهاب القولون التقرحي ومرض كرون. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتقييم الآثار المضادة الأولى والضميرية للبروتينات الإشارات. الآثار المترتبة على هذه التقنية يمتد مسح الغاز في التقدم الجديد والالتهاب.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في التأثير الوراثي على التهاب الأمعاء. ويمكن أيضا أن تطبق على عوامل أخرى مثل الوجبات الغذائية والميكروبيوم. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذا الفصل الدراسي النضال لأن معالجة مرض ندبا هو صعب.
المرئية مظاهرة من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية كما تشريح وخطوات إعداد الأنسجة من الصعب تعلم لأن الغموض وهياكل أنسجة الخلية قد تتغير. للحث على كبريتات الدكستران، أو التهاب القولون DDS، استبدال مياه الشرب العادية مع حل DSS 3٪، إضافة libidium لمدة سبعة أيام. قياس وزن الجسم لكل من الماوس، واستهلاك حل DSS، وإنتاج البراز يوميا.
في نهاية العلاج لمدة سبعة أيام، ضع الفأر في موضعه supine واستخدم مقص صغيرًا لإجراء شق متوسط بطول ثلاثة سنتيمترات في البطن. حصاد الطحال وقياس حجمه. ثم استخدام ملقط لرفع القولون للسماح لها أن تكون منفصلة عن mesentery المحيطة بها.
واستخراج القولون كله حتى cecum والمستقيم مرئية. احول النسيج عند هامش القولون. وعميق داخل الحوض لتحرير القولون القريب والهد، على التوالي.
قياس وتسجيل طول القولون المعزول. واستخدم حقنة 10 ملليلتر مجهزة بإبرة غافاج لطرد القولون بـ 10 ملليلترات من الثلج البارد PBS لإزالة البراز والدم حتى تصبح الإضاءة واضحة. لتحديد النسيج، تقسيم عينات الأنسجة إلى أقسام متساوية الحجم في نطاقات، متوسطة، وقاطعة.
وأصلح الأنسجة في 4٪ شبه شكلي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. للهماتروسيلين وosin تلطيخ أنسجة القولون المعزولة، في صباح اليوم التالي، غمر قطع الأنسجة في 30٪ السكروز وبرنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في أنابيب 15 ملليلتر الفردية لحماية التبريد من العينات. في اليوم التالي، تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع المثلى أو مركب OCT.
وتبريد الأنسجة في ناقص 20 درجة مئوية حتى تصلب أكتوبر. ضع كتل OCT في التبريد وتعيين الطلب السماك إلى 12 ميكرومتر. ثم شريحة وجمع 12 micrometer سميكة المقاطع المجمدة على الشرائح المجهر الزجاج.
عندما تم تقسيم جميع الأنسجة، وتسخين الشرائح في 65 درجة مئوية على لوحة ساخنة لمدة 20 دقيقة. وغسل المقاطع ساخنة لفترة وجيزة في الماء المقطر قبل تلطيخ مع حل تلطيخ الهماوكسيلين لمدة خمس دقائق. إزالة حل الهماوكسيلين الزائدة وتشغيلها في مياه الصنبور لمدة خمس دقائق.
وتفرق الأقسام مع 0.5٪ حمض الهيدروكلوريك في الإيثانول لمدة 30 ثانية، تليها شطف دقيقة واحدة تحت مياه الصنبور الجارية. بعد ذلك، قم بغسل العينات لمدة دقيقة واحدة في برنامج تلفزيوني. تليها غسل خمس دقائق أخرى تحت مياه الصنبور الجارية.
في نهاية الغسيل، غمر الأنسجة في سلسلة الإيثانول التصاعدي لمدة 10 ثوان في الغمر. تليها مكافحة الاحتواء في إيوسين لمدة دقيقتين. للجفاف من العينات، غمر الشرائح في 95٪ الإيثانول واثنين من التغييرات من 100٪ الإيثانول لمدة خمس دقائق لكل غمر.
تليها المقاصة مع اثنين أو خمس تغييرات دقيقة في إكسيلين. ثم يسجل تلف الأنسجة إلى القولون القريب والمتوسط والعصى لكل مجموعة تجريبية. للتحليل الكيميائي المناعي ، بعد تسخين الأقسام لمدة 20 دقيقة على اللوحة الساخنة ، قم بغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة 10 دقائق لكل غسيل.
والقضاء على بيروكسيديز الذاتية مع حضانة بيروكسيد الهيدروجين 3 دقيقة 3٪. في نهاية الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني كما هو موضح ومنع أي ربط غير محددة مع عازلة حظر لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم، استبدال العازلة حظر مع كوكتيل الأجسام المضادة الأساسية من الفائدة.
لاحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، الطامح محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة وغسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، احتضان الشرائح مع كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية ذات الحيوية المناسبة.
تليها وضع العلامات مع streptavidin مجمع بيروكسيديز الفجل في درجة حرارة الغرفة. لتصور الخلايا النشطة المناعية، قم بتسمية العينات باستخدام الداب حتى يتطور لون بني فاتح أو داكن. و counterstain الأقسام مع الهماوكسيلين و 0.3٪ الأمونيا المخففة.
عندما تجفف الشرائح، استخدم مجهرًا خفيفًا للحصول على صور حقل ساطعة لأقسام الأنسجة تحت التكبير 10x. واستخدام برنامج معالجة الصور لتحديد وقياس عدد سكان الخلايا المناعية ملحوظ في كل من ظهارة وبربريا لامينا. لتحليل التعبير الجيني في DSS معالجة القولون، استخراج RNA من ناقص 80 درجة مئوية عينات الأنسجة القولونية المذاب وفقا لبروتوكولات استخراج الحمض النووي الريبي القياسية.
وخلط ميكروغرام واحد مع الجيش الملكي النيبالي الكلي مع 2.5 ميكرولترات من 20 ملليمولار oligo deoxythymidine 12 من خلال 18 التمهيدية وميكر واحد من مولولي ميرين سرطان الدم فيروس عكس النسخ العكسي. بعد حضانة 60 دقيقة في 42 درجة مئوية، مزيج ميكرولتر واحد من cDNA مع 0.5٪ microliters من الابايات PCR الكمية المناسبة إلى الأمام وعكس لcytokines من الفائدة و 2x صبغة خضراء فلورية. ثم تشغيل PCR الكمية تحت المعلمات المناسبة وحساب التعبير الجيني النسبي وفقا للبروتوكولات القياسية.
بالمقارنة مع الفئران wildtype، ألفا gustducin الفئران خروج المغلوب المعرض التهاب القولون أكثر شدة مع فقدان الوزن المفرط والإسهال والنزيف المعوي. بعد سبعة أيام من إدارة DSS ، يكشف التحليل النسيجي لأقسام القولون عن تلف الأنسجة الأكثر تفاقمًا داخل القولون القريب والمتوسط والهدّي للفئران خروج المغلوب ، مقارنة بنظرائهم من النوع البري. يؤدي هذا التنشيط المناعي المفرط إلى تحريض التهاب القولون مع تسلل قوي للخلايا الالتهابية المختلفة في القولون الحيواني بالضربة القاضية كما لوحظ من خلال التحليل المناعي الكيميائي.
علاوة على ذلك، التحليل الكمي PCR يوضح مستويات أعلى من TNF ألفا وferon غاما التعبير ولكن التعبير أقل من IL-5، 10، و 13، في خروج المغلوب مقارنة مع القولون الماوس wildtype مع عدم وجود فرق في بيتا TGF تعبير واحد لوحظ. أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم أن نتذكر لتحسين textorous جرعة الصوديوم southvater ومدة مظاهرة. إعادة توجيه هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طريقة أخرى مثل الحصول على الثقافة من أجل فهم أسئلة إضافية مثل تأثير التهاب في أصل الأنسجة المعوية.
بعد تطورها ، تمهد هذه التقنية طريقة للباحثين في مجال التهاب الأمعاء لاستكشاف مساهمات الطفرات الجينية في شدة تآكل البيوديس وغيرها من الفقاريات. لا ننسى أن العمل مع أنسجة الأمعاء المرض ومحتوياته يمكن أن تكون خطرة للغاية، وتداعيات مثل ارتداء الأشياء التي هي مناسبة، والحماية الشخصية الدائمة ينبغي دائما أن تؤخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
