이 방법은 궤양성 대장염과 크론병에 대한 염증성 생물 질환 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신호 단백질의 첫 번째 항 및 proinfammatory 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 새로운 진보와 염증에 있는 가스의 조사를 확장합니다.
이 방법은 창 자 염증에 유전 효과에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 규정식과 microbiome와 같은 그밖 요인에 적용될 수 있습니다. 일반적으로, 이 학기에 새로 들어본 개인은 질병 흉터 조직을 처리하는 것이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
이 방법의 시각적 데모는 해부와 조직 준비 단계는 mystalia 및 세포 조직 구조가 변경될 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. dextran 황산 나트륨, 또는 DDS 대장염을 유도하기 위해 일반 식수를 3 %DSS 용액으로 대체하고 7 일 동안 libidium을 추가하십시오. 각 마우스의 체중, DSS 용액 소비 및 대변 생산을 매일 측정합니다.
7일 치료 가끝나면 마우스를 척추 위치에 놓고 작은 가위를 사용하여 복부에 3센티미터 길이의 중간선 절개를 합니다. 비장을 수확하고 크기를 측정합니다. 그런 다음 집안을 들어 올려 주변 간질에서 분리할 수 있도록 집게를 사용합니다.
그리고 cecum과 직장이 보일 때까지 전체 결장추출. 대장 내시경 마진에서 조직을 분리합니다. 그리고 골반 깊숙이 각각 근위와 결장이 해제됩니다.
격리된 결장의 길이를 측정하고 기록합니다. 그리고 10 밀리리터 주사기를 사용하여 10 밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 결장세척제로 결장세척기를 사용하여 유언장과 혈액을 제거합니다. 조직학적 식별을 위해 조직 샘플을 동등하게 크기의 근위, 중간 및 단면으로 나눕니다.
그리고 4섭씨에서 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드로 조직을 수정합니다. 고립 된 결장 조직의 헤마톡클린과 에오신 염색의 경우, 다음 아침, 샘플의 극저온 보호를 위해 개별 15 밀리리터 튜브에 30 %의 자당과 PBS에 조직 조각을 잠급. 다음 날, 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물에 조직을 포함.
그리고 10 월 경화 될 때까지 영하 20도에서 조직을 냉각. 100000블록을 저온에 놓고 두께 다이얼을 12마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 슬라이스하고 유리 현미경 슬라이드에 12 마이크로 미터 두께의 냉동 섹션을 수집합니다.
모든 조직이 절제되면 슬라이드를 핫 플레이트에서 섭씨 65도에서 20 분 동안 따뜻하게하십시오. 그리고 가열 된 부분을 증류수로 간단히 씻은 후 헤마톡실린 염색 용액으로 5 분 동안 염색하십시오. 과도한 헤마톡슬린 용액을 제거하고 5분 동안 수돗물로 실행합니다.
그리고 에탄올에 0.5%의 염산으로 30초 동안 단면을 구별하고, 흐르는 수돗물 하에서 1분간 헹구는 것이다. 다음으로 PBS에서 1분 동안 샘플을 세척합니다. 그 다음에 는 흐르는 수돗물 아래에서 5분간 세척합니다.
세척이 끝나면 침수당 10초 동안 오름차순 에탄올 계열에 티슈를 담급합니다. 그 다음에 는 2분 동안 에오신에 반격이 이어졌습니다. 시료의 탈수의 경우 슬라이드를 95%에탄올에 담그고 침수당 5분 동안 100% 에탄올의 두 가지 변화를 담급드십시오.
그 다음에 는 자일렌의 2분, 5분 교체로 클리어링이 이어졌습니다. 그런 다음 각 실험 군의 근위, 중간 및 말단 결장에 대한 조직 손상을 점수로 작성합니다. 면역집중화학적 분석을 위해, 핫 플레이트에서 20분 동안 섹션을 따뜻하게 한 후, PBS에서 슬라이드를 세척당 10분 동안 세 번 세척합니다.
그리고 10 분 3 % 과산화수소 배양으로 내인성 과산화증을 제거합니다. 인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 PBS에서 시료를 세 번 세척하고 실온에서 최소 한 시간 동안 블로킹 버퍼로 임의의 비특이적 결합을 차단한다. 그런 다음 차단 버퍼를 관심있는 1 차 항체 칵테일로 대체하십시오.
섭씨 4도에서 하룻밤 잠복식. 다음 날 아침, 초과 1차 항체 용액을 흡인시키고 PBS에서 슬라이드를 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 적절한 바이오티니드 이차 항체 칵테일로 슬라이드를 배양합니다.
그 다음에는 실온에서 스트렙타비딘 고추냉이 과록시다제 복합체로 라벨을 붙입니다. 면역 반응성 세포를 시각화하려면 밝은 갈색 또는 어두운 갈색이 발생할 때까지 샘플을 DAB로 레이블을 지정합니다. 그리고 헤마톡시린과 0.3%의 희석암모니아로 섹션을 카운터스테인.
슬라이드가 건조되면 가벼운 현미경을 사용하여 10배 배율 하에서 조직 섹션의 밝은 필드 이미지를 얻습니다. 그리고 상피와 라미나 프로프리아 모두에서 표시된 면역 세포의 인구를 식별하고 정량화하기 위해 이미지 처리 프로그램을 사용합니다. DSS 처리 결장에서 유전자 발현 분석을 위해, 표준 RNA 추출 프로토콜에 따라 영하 80도 에서 RNA를 해동 대장 조직 샘플에서 추출.
그리고 총 RNA와 20 밀리머 올리고 데옥시티미드 12~18개의 프라이머와 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사 1마이크로리터와 1마이크로그램을 혼합한다. 섭씨 42도에서 60분 동안 배양한 후, cDNA의 마이크로리터 1개를 적절한 전방 및 역정양 PCR 프라이머의 0.5% 마이크로리터와 혼합하여 관심 있는 사이토카인과 2배 형광 녹색 염료를 사용한다. 그런 다음 적절한 매개 변수하에서 정량적 PCR을 실행하고 표준 프로토콜에 따라 상대적 유전자 발현을 계산합니다.
야생형 마우스에 비해, 알파 gustducin 녹아웃 마우스는 과도한 체중 감소, 설사 및 장 출혈로 더 심한 대장염을 나타낸다. DSS 투여 7일 후, 결장 섹션의 조직학적 분석은 그들의 야생형 대조에 비해 녹아웃 마우스의 근위, 중간 및 탈결내의 조직 손상을 더 악화시켰다. 이 과도한 면역 활성화는 면역 성화학 적 분석에 의해 관찰된 녹아웃 동물 결장에서 다양한 염증 세포의 강력한 침투와 대장염의 유도로 이어집니다.
또한, 정량PCR 분석은 TNF 알파 및 인페론 감마 발현의 상부를 보여 주지만, TGF 베타 1발현에 차이가 없는 야생형 마우스 결장과 비교하여 IL-5, 10 및 13의 낮은 발현을 나타내고 있다. 이 절차를 시도하는 동안, 텍스트 남바터 나트륨 복용량 및 데모 기간을 최적화 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다. 이 절차를 전달, 문화를 획득 같은 다른 방법은 장 조직 기원에 염증의 효과 같은 추가 질문을 이해하기 위해 수행 될 수있다.
개발 후, 이 기술은 창자 염증 분야의 연구원들이 생물 질환 침식 및 기타 척추 동물의 심각성에 대한 유전자 돌연변이의 기여를 탐구하는 방법을 열어줍니다. 질병 창자 조직 및 그 내용물로 일하는 것은 매우 위험할 수 있고 적절한 물건을 착용하는 것과 같은 영향은 항상이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 영구적 인 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
