Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de biodisease inflamatória sobre colite ulcerativa e doença de Crohn. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para avaliar os primeiros efeitos anti e proinfammatórios das proteínas de sinalização. A implicação dessa técnica amplia o levantamento do gás em novos avanços e inflamações.
Embora este método possa fornecer insights sobre o efeito genético na inflamação intestinal. Também pode ser aplicado a outros fatores, como dietas e microbioma. Geralmente, indivíduos novos para este semestre vão lutar porque processar o tecido da cicatriz da doença é complicado.
A demonstração visual deste método é fundamental, pois a dissecção e as etapas de preparação tecidual são difíceis de aprender porque a mistalia e as estruturas dos tecidos celulares podem ser alteradas. Para induzir o sódio sulfato dextran, ou colite DDS, substitua a água potável regular por uma solução de 3% DSS, adicione libidium por sete dias. Medindo o peso corporal de cada rato, o consumo de solução DSS e a produção de fezes diariamente.
Ao final do tratamento de sete dias, coloque o rato na posição supina e use uma tesoura pequena para fazer uma incisão média de três centímetros de comprimento no abdômen. Colher o baço e medir seu tamanho. Em seguida, use fórceps para levantar o cólon para permitir que ele seja separado da mesenteria circundante.
E extrair todo o cólon até que o ceco e o reto sejam visíveis. Transecte o tecido na margem colonosecal. E no fundo da pélvis para libertar o cólon proximal e distal, respectivamente.
Meça e regise o comprimento do cólon isolado. E use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de gavage para lavar o cólon com 10 mililitros de PBS gelado para remover as fezes e o sangue até que o illuate se esclalha. Para identificação histológica, divida as amostras de tecido em seções proximais, médias e distais igualmente dimensionadas.
E fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído durante a noite a 4 graus Celsius. Para a hematoxilina e a coloração de eosina do tecido isolado do cólon, na manhã seguinte, submergir os pedaços de tecido em 30% de sacarose e PBS durante a noite em tubos individuais de 15 mililitros para proteção criogênico das amostras. No dia seguinte, incorporou os tecidos em temperatura de corte ideal ou composto oct.
E esfrie os tecidos em menos 20 graus Celsius até que o OCT endureça. Coloque os blocos OCT no criostat e defina o mostrador de espessura para 12 micrômetros. Em seguida, corte e colete seções congeladas de 12 micrômetros de espessura em lâminas de microscópio de vidro.
Quando todos os tecidos tiverem sido seccionados, aqueça os slides a 65 graus Celsius em uma placa quente por 20 minutos. E lave as seções aquecidas brevemente em água destilada antes de coloração com solução de coloração de hematoxilina por cinco minutos. Remova a solução de hematoxilina em excesso e corra na água da torneira por cinco minutos.
E diferenciar as seções com ácido clorídrico de 0,5% no etanol por 30 segundos, seguido por uma lavagem de um minuto sob água da torneira corrente. Em seguida, lave as amostras por um minuto na PBS. Seguido por mais cinco minutos de lavagem sob água da torneira corrente.
No final da lavagem, submergir os tecidos em uma série ascendente de etanol por 10 segundos por imersão. Seguido por contra-retenção em eosin por dois minutos. Para desidratação das amostras, submergir os slides em 95% de etanol e duas alterações de 100% de etanol por cinco minutos por imersão.
Seguido por compensação com duas, cinco minutos de mudanças no xileno. Em seguida, escore os danos teciduais nos cólons proximais, médios e distais de cada grupo experimental. Para análise imunohistoquímica, depois de aquecer as seções por 20 minutos na placa quente, lave os slides três vezes em PBS por 10 minutos por lavagem.
E elimine a peroxidase endógena com uma incubação de peróxido de hidrogênio de 10 minutos e 3%. No final da incubação, lave as amostras três vezes em PBS como demonstrado e bloqueie qualquer ligação inespecífica com tampão de bloqueio por pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o tampão de bloqueio pelo coquetel de anticorpos primário de interesse.
Para uma incubação durante a noite a 4 graus Celsius. Na manhã seguinte, aspire a solução de anticorpos primários em excesso e lave os slides três vezes na PBS. Após a última lavagem, incubar os slides com o coquetel de anticorpos secundários biotinylated apropriado.
Seguido pela rotulagem com complexo de peroxidase de rabanete streptavidin à temperatura ambiente. Para visualizar as células imuno-reativas, rotule as amostras com DAB até que uma cor marrom clara ou escura se desenvolva. E contra-retiver as seções com hematoxilina e amônia diluída de 0,3%.
Quando os slides secarem, use um microscópio leve para obter imagens de campo brilhante das seções teciduais sob uma ampliação de 10x. E usar um programa de processamento de imagem para identificar e quantificar a população das células imunes marcadas tanto no epitélio quanto na álmina propria. Para análise de expressão genética em cólons tratados com DSS, extraia RNA de menos 80 graus Celsius descongelou amostras de tecidocónico de acordo com os protocolos padrão de extração de RNA.
E misture um micrograma com o RNA total com 2,5 microlitros de 20 milimões oligo deoxythymidine 12 a 18 primers e um microliter de moloney murine leucemia vírus reversa transcriptase. Após uma incubação de 60 minutos a 42 graus Celsius, misture um microliter do cDNA com microlitros de 0,5% dos primers pcr quantitativos adequados para frente e reverso para as citocinas de interesse e corante verde fluorescente de 2x. Em seguida, execute o PCR quantitativo sob os parâmetros apropriados e calcule a expressão genética relativa de acordo com os protocolos padrão.
Em comparação com ratos de tipo selvagem, os camundongos eliminatórios de gustducina alfa exibem uma colite mais grave com perda excessiva de peso, diarreia e sangramento intestinal. Após sete dias de administração do DSS, a análise histológica das seções de cólon revela um dano tecidual mais agravado dentro dos cólons proximais, médios e distais dos camundongos eliminados, em comparação com seus homólogos wildtype. Essa ativação imunológica excessiva leva à indução de colite com uma infiltração robusta de várias células inflamatórias no cólon animal nocaute, como observado pela análise imunohistoquímica.
Além disso, a análise quantitativa do PCR demonstra níveis mais elevados de TNF alfa e expressão gama inferon, mas expressão inferior de IL-5, 10 e 13, em nocaute em comparação com cólons de camundongos de tipo selvagem sem diferença no beta TGF uma expressão observada. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar a dosagem de sódio e a duração da demonstração. Encaminhando esse procedimento, outro método como a obtenção de cultura pode ser realizado para entender questões adicionais como o efeito da inflamação na originação do tecido intestinal.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo da inflamação intestinal explorarem as contribuições das mutações genéticas para a gravidade das erosãos biodisease e outros vertebrados. Não se esqueça que trabalhar com tecido intestinal da doença e seu conteúdo pode ser extremamente perigoso e as repercussões como usar coisas que são apropriadas, proteção pessoal permanente devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
