Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biodiseasa inflamatoria sobre la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar para evaluar los primeros efectos anti y proinfamatorios de las proteínas de señalización. La implicación de esta técnica extiende la encuesta de gas en nuevos avances e inflamación.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el efecto genético sobre la inflamación intestinal. También se puede aplicar a otros factores como dietas y microbioma. Generalmente, los individuos nuevos en este semestre tendrán problemas porque el procesamiento del tejido cicatricial de la enfermedad es complicado.
La demostración visual de este método es crítica ya que la disección y los pasos de preparación del tejido son difíciles de aprender porque la mistalia y las estructuras del tejido celular pueden ser alteradas. Para inducir sulfato dextrano sódico, o colitis DDS, reemplace el agua potable regular con una solución de 3%DSS, agregue libidio durante siete días. Medición diaria del peso corporal de cada ratón, el consumo de soluciones DSS y la producción de heces.
Al final del tratamiento de siete días, coloque el ratón en la posición supina y use tijeras pequeñas para hacer una incisión de línea media de tres centímetros de largo en el abdomen. Cosecha el bazo y mide su tamaño. A continuación, utilice fórceps para levantar el colon para permitir que se separe del mesente de los alrededores.
Y extrae todo el colon hasta que el cecum y el recto sean visibles. Transecte el tejido en el margen colonosecal. Y en el interior de la pelvis para liberar el colon proximal y distal, respectivamente.
Mida y registre la longitud del colon aislado. Y utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de gavage para lavar el colon con 10 mililitros de PBS helado para eliminar las heces y la sangre hasta que el ini litro quede limpio. Para la identificación histológica, divida las muestras de tejido en secciones proximales, medias y distales de igual tamaño.
Y fijar los tejidos en 4%paraformaldehído durante la noche a 4 grados Celsius. Para la tinción de hematoxilina y eosina del tejido aislado del colon, a la mañana siguiente, sumerja las piezas de tejido en 30%sacarosa y PBS durante la noche en tubos individuales de 15 mililitros para la protección criogénica de las muestras. Al día siguiente, incrustar los tejidos en la temperatura de corte óptima o compuesto OCT.
Y enfríe los tejidos en menos 20 grados Celsius hasta que el OCT se endurezca. Coloque los bloques OCT en el criostato y ajuste el dial de espesor a 12 micrómetros. A continuación, corte y recoja secciones congeladas de 12 micrómetros de espesor en diapositivas de microscopio de vidrio.
Cuando todos los tejidos hayan sido seccionados, calienta los portaobjetos a 65 grados Celsius en una placa caliente durante 20 minutos. Y lave brevemente las secciones calentadas en agua destilada antes de manchar con solución de tinción de hematoxilina durante cinco minutos. Retire el exceso de solución de hematoxilina y corra en agua del grifo durante cinco minutos.
Y diferencia las secciones con 0.5% ácido clorhídrico en etanol durante 30 segundos, seguido de un enjuague de un minuto bajo agua corriente del grifo. A continuación, lave las muestras durante un minuto en PBS. Seguido de otro lavado de cinco minutos bajo el agua corriente del grifo.
Al final del lavado, sumerja los tejidos en una serie ascendente de etanol durante 10 segundos por inmersión. Seguido de contramancha en eosina durante dos minutos. Para la deshidratación de las muestras, sumerja los portaobjetos en 95%etanol y dos cambios de 100%etanol durante cinco minutos por inmersión.
Seguido de claro con dos, cinco cambios de minutos en xileno. Luego anota el daño tisular en los colones proximal, medio y distal de cada grupo experimental. Para el análisis inmunohistoquímico, después de calentar las secciones durante 20 minutos en la placa caliente, lave los portaobjetos tres veces en PBS durante 10 minutos por lavado.
Y eliminar la peroxidasa endógena con una incubación de peróxido de hidrógeno de 10 minutos 3%. Al final de la incubación, lave las muestras tres veces en PBS como se ha demostrado y bloquee cualquier unión no específica con tampón de bloqueo durante al menos una hora a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el tampón de bloqueo por el cóctel de anticuerpos primario de interés.
Para una incubación nocturna a 4 grados centígrados. A la mañana siguiente, aspirar el exceso de solución de anticuerpos primarios y lavar las diapositivas tres veces en PBS. Después del último lavado, incubar los portaobjetos con el cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados adecuado.
Seguido por el etiquetado con complejo de rábana de rábano picante estreptavidina a temperatura ambiente. Para visualizar las células inmunorreactivas, etiquete las muestras con DAB hasta que se desarrolle un color marrón claro u oscuro. Y contraataca las secciones con hematoxilina y 0,3% de amoníaco diluido.
Cuando las diapositivas se hayan secado, utilice un microscopio de luz para obtener imágenes de campo brillante de las secciones de tejido bajo un aumento de 10x. Y utilice un programa de procesamiento de imágenes para identificar y cuantificar la población de las células inmunitarias marcadas tanto en el epitelio como en la lámina propria. Para el análisis de expresión génica en colones tratados con DSS, extraiga ARN de menos 80 grados Celsius descongelados muestras de tejido colónico de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ARN.
Y mezcle un microgramo con el ARN total con 2,5 microlitros de 20 desoximidina de 20 mililitrolares de deoxicitomida 12 a 18 imprimaciones y un microlitro de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de moloney. Después de una incubación de 60 minutos a 42 grados Celsius, mezcle un microlitro del ADNc con 0,5%microlitros de las imprimaciones PCR cuantitativas delanteras e inversas adecuadas para las citoquinas de interés y el tinte verde fluorescente 2x. A continuación, ejecute el PCR cuantitativo bajo los parámetros apropiados y calcule la expresión génica relativa de acuerdo con los protocolos estándar.
En comparación con los ratones de tipo salvaje, los ratones alfa gustducin knockout exhiben una colitis más grave con pérdida de peso excesiva, diarrea y sangrado intestinal. Después de siete días de administración de DSS, el análisis histológico de las secciones del colon revela un daño tisular más agravado dentro de los colones proximales, medios y distales de los ratones nocaut, en comparación con sus homólogos de tipo salvaje. Esta activación inmune excesiva conduce a la inducción de la colitis con una infiltración robusta de varias células inflamatorias en el colon animal knockout como se observa en el análisis inmunohistoquímico.
Además, el análisis cuantitativo de PCR demuestra niveles más altos de expresión gamma alfa e inferón de TNF, pero menor expresión de IL-5, 10 y 13, en nocaut en comparación con los dos puntos de ratón de tipo salvaje sin diferencia en TGF beta una expresión observada. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar la dosis de sodio de southvater textoso y la duración de la demostración. Reenvío de este procedimiento, otro método como la obtención de cultivo se puede realizar con el fin de entender preguntas adicionales como el efecto de la inflamación en la originación del tejido intestinal.
Después de su desarrollo, esta técnica allana un camino para que los investigadores en el campo de la inflamación intestinal exploren las contribuciones de las mutaciones genéticas a la gravedad de los erosiones biodiseas y otros vertebrados. No olvide que trabajar con el tejido intestinal de la enfermedad y su contenido puede ser extremadamente peligroso y las repercusiones tales como el uso de cosas que son apropiadas, la protección personal permanente siempre debe tomarse durante la realización de este procedimiento.
