يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل كليبسيلا، مثل الجينات التي تستخدم لتنظيم الكبسولة والضراوة المرتبطة بها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر وسيلة لفصل السلالات المقلبة وغير المقلبة جسديا، ويمكن أيضا أن تستخدم للمقارنات السريعة بين سلالات إنتاج الكبسولات. على الرغم من أن هذه الطريقة قد وضعت لدراسة تنظيم كبسولة في Klebsiella، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على الأنواع البكتيرية المختلفة.
عموما الأفراد الذين هم جديدة لهذا الأسلوب سوف النضال لأن صب التدرجات وإضافة الخلايا إلى التدرجات يمكن أن يكون من الصعب جدا. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية، حيث نعرض التقنيات التي يصعب إتقانها، وتقديم اقتراحات ونصائح لمساعدة المستخدم. للبدء، حدد مستعمرة واحدة من لوحة الأسهم مع حلقة معقمة، وتطعيم 10 ملليلتر من مرق مناسب.
احتضان الثقافة بين عشية وضحاها. ثم نقل الثقافة إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي. بعد ذلك ، والتخلص من الماثرة ، وإعادة تعليق بيليه في ملليلترين من برنامج تلفزيوني.
كرر الطرد المركزي، وتجاهل المابير الناتجة. ثم إعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. لإنشاء تخفيفات تدرج الكثافة، والجمع بين الكثافة المتوسط التدرج مع برنامج تلفزيوني.
ثم aliquot 600 ميكرولترات من كل تخفيف التدرج في أنابيب ميليلتر الفردية. تناول 100 ميكرولترات من الخلايا مع ماصة 200 ميكرولتر، ووضع طرف ماصة على جانب الأنبوب فقط تحت الغضروف المفصلي لأحد التدرجات العديدة. استلهم الخلايا البكتيرية على التدرج ببطء شديد ، مع الحرص على عدم مزج الواجهة.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب المعدة لمدة 10 دقائق في 8،000 غرام. بعد ذلك، قم بنقل الأنابيب إلى رف لتصور الحد الأدنى من تخفيف التدرج المطلوب للاحتفاظ بالخلايا فوق طبقة التدرج. أولاً، نقل ملليلتر واحد من تخفيف التدرج الكثافة الأكثر تمييعًا إلى أنبوب دائري القاع من خمسة ملليلتر.
باستخدام حقنة مع إبرة 1.5 بوصة، يستغرق مليلتر واحد من تدرج الكثافة الأكثر تركيزا المقبل. ضع الإبرة في الجزء السفلي من الأنبوب وحقن محتويات الحقنة ببطء شديد. يجب أن يكون هناك واجهة واضحة في كل خطوة من تدرج الكثافة.
إذا كانت الطبقات مزيج، فإنك لن تحقق فصل نظيف من البكتيريا الخاصة بك. إزالة إبرة من التدرج بلطف حتى لا يزعج واجهة بين التخفيفات التدرج. ثم ضع الأنبوب في رف.
إضافة بعناية 600 ميكرولترات من الخلايا المعدة إلى أعلى التدرج في الأنبوب. ثم ضع الأنبوب في محول أنبوب، وزن الأنبوب مع المحول لضمان التوازن. بعد ذلك، ضع محول الأنبوب في دوار زاوية ثابتة داخل جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء، والطرد المركزي الأنبوب لمدة 30 دقيقة في 3،000 ز.
وأخيرا، بعد الطرد المركزي، وإزالة الأنبوب بعناية، وضعه في رف، وتصوير النتائج. في هذا البروتوكول، تم استخدام الطرد المركزي للتدرج الكثافة لفصل السلالات البكتيرية على أساس كمية الكبسولة التي تنتجها. على الرغم من أن النتائج الدقيقة تعتمد على الأنواع البكتيرية، فإن معظم السلالات سوف تهاجر إلى موقع واحد داخل التدرج.
وينبغي أن يؤدي تطبيق هذه الطريقة إلى مكتبة بكتيريا متحولة إلى إنتاج نطاق رئيسي فوق التدرج، وشريط أقل كثافة من خلال الطبقة العليا من التدرج، وكسر صغير في الأسفل. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن واجهات التدرج لا ينبغي أن تكون مختلطة، وينبغي أن التدرج لا تحتوي على فقاعات الهواء. بعد الإجراء، ينبغي تنفيذ طرق التحقق من الصحة مثل مقايسة حمض أوريك أو المجهر لفحص كميات الكبسولة.
وهذا مهم بشكل خاص عند استخدام هذه التقنية لسلالات جديدة. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض مجموعة 2 قد تكون خطيرة. وينبغي دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل معدات الحماية التصحيحية، والتقيد بتقييم المخاطر، والتخلص من الثقافات بشكل صحيح، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
