이 방법은 캡슐 및 관련 악성 종양을 조절하기 위하여 어떤 유전자가 이용되는 것과 같은 Klebsiella 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캡슐화 및 비 캡슐화된 균주를 물리적으로 분리하는 수단을 제공하고 캡슐 생산균 사이의 신속한 비교에도 사용될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 Klebsiella에서 캡슐 조절을 연구하기 위하여 개발되었지만, 또한 다른 세균성 종에 적용될 수 있습니다.
일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 그라데이션을 붓고 세포를 그라데이션에 추가하는 것이 매우 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 마스터하기 어려운 기술을 보여 주므로 사용자를 돕기 위한 제안 및 팁을 제공하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 멸균 루프가 있는 스톡 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 적절한 국물의 10 밀리리터를 접종합니다.
하룻밤 문화를 배양하십시오. 그런 다음 문화를 15 밀리리터 튜브 및 원심분리기로 옮기습니다. 다음으로, 상체를 버리고 PBS의 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
원심분리를 반복하고 결과 상체부를 폐기합니다. 그런 다음 PBS의 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 밀도 그라데이션 희석을 만들려면 밀도 그라데이션 배지와 PBS를 결합합니다.
그런 다음 각 그라데이션 희석의 600 마이크로리터를 개별 2 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 200 마이크로리터 파이펫으로 100마이크로리터의 셀을 차지하고, 많은 그라데이션 중 하나의 반월 상 연골 바로 아래에 피펫 팁을 놓습니다. 세균 세포를 매우 천천히 그라데이션에 흡인하여 인터페이스를 혼합하지 않도록 주의하십시오.
8, 000g에서 10 분 동안 준비 된 튜브를 원심 분리합니다. 그 후 튜브를 랙으로 옮겨 그라데이션 층 바로 위에 세포를 유지하는 데 필요한 최소 그라데이션 희석을 시각화합니다. 첫째, 가장 희석밀도 그라데이션 희석제 1밀리리터를 5밀리리터 라운드 하단 튜브로 옮킨다.
1.5 인치 바늘주사기를 사용하여 다음 가장 집중 된 밀도 그라데이션의 1 밀리리터를 차지하십시오. 바늘을 튜브 바닥에 놓고 주사기의 내용을 매우 천천히 주입합니다. 밀도 그라데이션의 각 단계에서 명확한 인터페이스가 있어야 합니다.
층이 혼합되면 박테리아의 깨끗한 분리를 달성하지 않습니다. 그라데이션 희석제 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록 그라데이션에서 바늘을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 튜브를 랙에 놓습니다.
조심스럽게 튜브의 그라데이션의 상단에 준비 된 세포의 600 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브 어댑터에 튜브를 배치하고 균형을 보장하기 위해 어댑터로 튜브의 무게를 측정합니다. 그 후, 튜브 어댑터를 벤치 상단 원심분리기 내에 고정 각도 로터에 놓고 튜브를 300g에서 30분 동안 원심분리합니다.
마지막으로 원심 분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 랙에 배치하고 결과를 촬영합니다. 이 프로토콜에서 밀도 그라데이션 원심분리는 생산하는 캡슐의 양에 따라 세균균을 분리하는 데 사용되었습니다. 정확한 결과는 세균성 종에 따라 달라지지만 대부분의 균주는 그라데이션 내의 단일 위치로 이동합니다.
세균 돌연변이 라이브러리에 이 방법을 적용하면 그라데이션 위의 주요 대역, 그라데이션의 최상위 층을 통한 밀도가 떨어지는 대역, 하단의 작은 캡슐 분획을 생성해야 한다. 이 절차를 시도하는 동안 그라데이션 인터페이스를 혼합해서는 안 되며 그라데이션에는 기포가 포함되어서는 안 된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 절차에 따라, 비뇨기과산 분석또는 현미경 검사법과 같은 검증 방법은 캡슐 양을 검사하기 위해 수행되어야 한다.
이것은 새로운 균주에 대 한이 기술을 사용 하는 경우에 특히 중요 한. 위험 그룹 2 병원균과 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 교정 보호 장비, 위험 평가 준수 및 문화 간 올바르게 폐기와 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
