この方法は、どの遺伝子がカプセルおよび関連する毒性を調節するために使用されるかなど、クレブシエラ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、カプセル化株と非カプセル株を物理的に分離する手段を提供し、カプセル産生の株間の迅速な比較にも使用できることである。この方法は、クレブシエラのカプセル規制を研究するために開発されましたが、それはまた、異なる細菌種に適用することができます。
一般に、この方法に新しい人は、勾配を注ぎ、グラデーションに細胞を追加することは非常に困難であるため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、習得が困難な手法を示し、ユーザーに役立つヒントを提供するため、非常に重要です。まず、滅菌ループを有するストックプレートから1コロニーを選択し、適切なスープを10ミリリットルに接種する。
培養を一晩インキュベートする。その後、培養液を15ミリリットルチューブ、および遠心分離機に移す。次に上清を捨て、2ミリリットルのPBS中でペレットを再懸濁する。
遠心分離を繰り返し、得られた上清を捨てます。その後、PBSの2ミリリットルでペレットを再中断します。密度勾配希釈を作成するには、密度勾配媒体とPBSを組み合わせます。
次に、各勾配希釈液のアリコート600マイクロリットルを個々の2ミリリットルチューブにする。200マイクロリットルピペットで100マイクロリットルの細胞を取り、多くの勾配の1つの半月板のすぐ下のチューブの側面にピペットチップを置きます。細菌細胞を非常にゆっくりと勾配に吸引し、界面を混ぜないように注意する。
8,000 gで10分間、予め処理したチューブを遠心します。この後、チューブをラックに移して、勾配層のすぐ上のセルを保持するために必要な最小の勾配希釈を視覚化します。まず、最も希薄な密度勾配希釈液の1ミリリットルを5ミリリットルのラウンドボトムチューブに移します。
1.5インチの針を持つ注射器を使用して、次の最も濃縮された密度勾配の1ミリリットルを取ります。針をチューブの底に置き、注射器の内容物を非常にゆっくりと注入します。密度勾配の各ステップには、明確なインタフェースが必要です。
層が混ざると、細菌のきれいな分離はできません。勾配希釈間の界面を乱さないように、グラデーションから針を緩やかに取り除きます。その後、チューブをラックに入れ、
慎重にチューブ内の勾配の上部に調製された細胞の600マイクロリットルを追加します。チューブアダプターにチューブを置き、バランスを確保するためにアダプターでチューブの重量を量ります。その後、ベンチトップ遠心分離機内の固定角度ローターにチューブアダプターを置き、3,000 gで30分間チューブを遠心します。
最後に、遠心分離後、チューブを慎重に取り出し、ラックに入れ、結果を撮影します。このプロトコルでは、密度勾配遠心分離は、それらが生成するカプセルの量に基づいて細菌株を分離するために使用された。正確な結果は細菌種に依存しますが、ほとんどの株は勾配内の単一の場所に移動します。
この方法を細菌変異ライブラリーに適用すると、勾配の上方の主要バンド、勾配の最上層を通る密度の低いバンド、下部に小さなアキャップスフラ画が生成される。この手順を試みる際には、グラデーションインターフェイスを混在させてはならないことに注意してください。手順に従って、ウロン酸アッセイや顕微鏡検査などの検証方法を実施して、カプセル量を調べる必要があります。
これは、新しい株のためにこの技術を使用する場合に特に重要です。ハザードグループ2病原体との作業は危険な場合があることを忘れないでください。この手順を実行する際には、常に、是正保護具、リスクアセスメントへの遵守、文化の適切な廃棄などの予防措置を講じてください。
