Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de Klebsiella, como quais genes são usados para regular cápsulas e virulentos associados. As principais vantagens desta técnica são que ela fornece um meio de separar fisicamente cepas capsuladas e não capsuladas, e também pode ser usada para comparações rápidas entre cepas de produção de cápsulas. Embora este método tenha sido desenvolvido para estudar a regulação da cápsula em Klebsiella, também pode ser aplicado a diferentes espécies bacterianas.
Geralmente, indivíduos que são novos neste método lutarão porque derramar os gradientes e adicionar as células aos gradientes pode ser bastante difícil. A demonstração visual desse método é fundamental, pois mostramos as técnicas difíceis de dominar, fornecendo sugestões e dicas para ajudar o usuário. Para começar, selecione uma única colônia a partir de uma placa de estoque com um laço estéril, e inocula 10 mililitros de um caldo apropriado.
Incubar a cultura da noite para o dia. Em seguida, transfira a cultura para um tubo de 15 mililitros, e centrífuga. Em seguida, descarte o supernasce, e suspenda a pelota em dois mililitros da PBS.
Repita a centrifugação e descarte o supernanato resultante. Em seguida, suspender novamente a pelota em dois mililitros de PBS. Para criar as diluições gradientes de densidade, combine o gradiente de densidade com o PBS.
Em seguida, alíquota de 600 microliters de cada diluição gradiente em dois tubos mililitros individuais. Pegue 100 microliters de células com uma pipeta de 200 microliteres, e coloque a ponta da pipeta na lateral do tubo logo abaixo do menisco de um dos muitos gradientes. Aspire as células bacterianas no gradiente muito lentamente, tomando cuidado para não misturar a interface.
Centrifugar os tubos preparados por 10 minutos a 8.000 g's. Depois disso, transfira os tubos para um rack para visualizar a diluição mínima de gradiente necessária para reter as células logo acima da camada gradiente. Primeiro, transfira um mililitro da diluição do gradiente de densidade mais diluída em um tubo de fundo redondo de cinco mililitros.
Usando uma seringa com uma agulha de 1,5 polegadas, pegue um mililitro do próximo gradiente de densidade mais concentrado. Coloque a agulha na parte inferior do tubo e injete o conteúdo da seringa muito lentamente. Deve haver uma interface clara em cada etapa do gradiente de densidade.
Se as camadas se misturarem, você não alcançará a separação limpa de suas bactérias. Remova a agulha do gradiente suavemente para não perturbar a interface entre as diluições do gradiente. Em seguida, coloque o tubo em um rack.
Adicione cuidadosamente 600 microliters das células preparadas ao topo do gradiente no tubo. Em seguida, coloque o tubo em um adaptador de tubo e pese o tubo com o adaptador para garantir o equilíbrio. Depois disso, coloque o adaptador de tubo em um rotor de ângulo fixo dentro de uma centrífuga de bancada e centrifugar o tubo por 30 minutos a 3.000 g's.
Finalmente, após a centrifugação, remova o tubo cuidadosamente, coloque-o em um rack e fotografe os resultados. Neste protocolo, a centrífuga gradiente de densidade foi usada para separar cepas bacterianas com base na quantidade de cápsula que produzem. Embora os resultados exatos dependam das espécies bacterianas, a maioria das cepas migrará para um único local dentro do gradiente.
A aplicação deste método a uma biblioteca mutante bacteriana deve produzir uma faixa principal acima do gradiente, uma faixa menos densa através da camada superior do gradiente, e uma pequena fração acapsular na parte inferior. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as interfaces gradientes não devem ser misturadas, e o gradiente não deve conter bolhas de ar. Após o procedimento, devem ser realizados métodos de validação, como o ensaio de ácido urônico ou microscopia para examinar as quantidades da cápsula.
Isso é especialmente importante ao usar esta técnica para novas cepas. Não se esqueça que trabalhar com patógenos do Hazard Group 2 pode ser perigoso. Precauções como equipamentos de proteção corretivos, adesão a avaliações de risco e descarte de culturas corretamente devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
