باستخدام المقايسات المعروضة هنا ، يمكن تقييم الفرق في النمط الظاهري بين سلالات فيروس الروتا ، حيث يتم عزل سلالات فريدة من نوعها. على وجه التحديد ، يتم التحقيق في تغيير الظاهرة من سلالات مقاومة للمطهرات من فيروس الروتا. لتحقيق نواتج كمية واضحة باستخدام اللويحات، من المهم اختيار مزيج مناسب من سلالة فيروس الروتا والمصل، حيث يتم تكييف الفيروس الروتا بشكل جيد مع المصل.
ومن خلال هذا الإجراء، سيكون "سيون سوك كادويا"، طالب دكتوراه من مختبري. قم بإزالة CryoTube الذي يحتوي على خطوط خلايا MA104 من حاوية النيتروجين السائل. ضع الـ CryoTube في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لذوبان الخلايا.
أضف ملليلترًا واحدًا من تعليق الخلية إلى 20 ملليلترًا من الوسيطة المحتوية على المصل في قارورة T75. احتضان القارورة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. مرة واحدة في الخلية monolayer تصل إلى 80٪ التقاء، وإزالة عظمى وغسل الخلايا مرتين مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X دولبيككو.
إضافة أربعة ملليلترات من 0.05٪ التربسين-EDTA إلى القارورة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا من القارورة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر، والطرد المركزي في 190 غرام لمدة خمس دقائق. تجاهل السوبر و resuspend الخلايا بيليه في ملليلتر واحد من المتوسطة التي تحتوي على المصل.
ثم تمييع الخلايا التي تم إيقافها 100 مرة مع الوسيط. إضافة ثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية المخفف إلى كل بئر من لوحة ستة بئر لمقايسة البلاك. إضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخففة إلى كل بئر من لوحة 24-well لمقايسة ربط الخلية.
احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة لمدة يومين أو ثلاثة أيام. نقل أنبوب يحتوي على ملليلتر واحد من تعليق الفيروس في وسيط خال من المصل من التخزين في ناقص 80 درجة مئوية إلى حمام الماء 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من التربسين من البنكرياس بورسين إلى ملليلتر واحد من تعليق الفيروس ثم دوامة.
احتضان تعليق الفيروس في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة لمدة 30 دقيقة. تخفيف تعليق الفيروس المنشط مع وسيط خال من المصل لضبط تعدد العدوى، أو وزارة الداخلية، إلى 0.1 بفو لكل خلية. أضف ملليلتر واحد من تعليق الفيروس المخفف إلى خلايا MA104 في قارورة T75 بعد ثلاثة أيام من طلاء الخلايا.
احتضان الخلايا مع الفيروس في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، يهز بلطف القارورة كل 15 دقيقة. ثم إضافة 30 ملليلتر من المتوسطة خالية من المصل تحتوي على أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من التربسين من البنكرياس بورسين إلى القارورة. احتضان القارورة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير مشبعة.
جمع ملليلتر واحد من عظمى في القارورة في صفر، ستة، 12، 18، 24، و 36 ساعة بعد العدوى، واستبدال عظمى في أنواع 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة. إجراء دورة التجميد في غضون 15 دقيقة عند ناقص 80 درجة مئوية تليها ذوبان لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ثم الطرد المركزي الأنابيب في 12، 600 غرام لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
جمع المناط. تصفية supernatant مع 0.2 ميكرون المقطر مرشح لإزالة كسر الخلية. تخزين فائقة في ناقص 80 درجة مئوية حتى تطبيقه على البلاك مقايسة لقياس تتر الفيروس.
عندما تكون على استعداد لأداء البلاك المقايسة، ووضع الأنابيب التي تحتوي على افراط التي تم جمعها في حمام مائي في 37 درجة مئوية. إضافة trypsin إلى ملليلتر واحد من عينة مخففة 10 أضعاف، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة، قم بغسل خلايا MA104 بعناية في طبق من ستة أطباق مع ملليلترين من PBS 1X بعد إزالة الوسيطة المحتوية على المصل.
قم بتخفيف العينات المحتضنة بشكل متسلسل مع المتوسطة الخالية من المصل وتلقين ملليلتر واحد من العينة المخففة في كل بئر. احتضان لوحة لمدة 90 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة، يهز بلطف لوحة كل 15 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة inoculum من لوحة ستة جيدا.
إضافة أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من التربسين إلى المتوسطة المعدة. بلطف ولكن على الفور إضافة ثلاثة ملليلتر من المتوسطة مختلطة مع جل agarose إلى كل بئر. السماح للجل agarose لترسيخ في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 10 دقيقة.
ثم احتضان لوحة لمدة يومين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بخار غير المشبعة. بعد ذلك، إضافة ملليلتر واحد من 0.015٪ حل أحمر محايد المخفف مع 1X PBS إلى كل بئر، واحتضان مع نفس الشروط. إزالة الصبغة بعد ثلاث ساعات والاستمرار في احتضان ليوم واحد.
في اليوم التالي، عد عدد من لويحات في كل بئر وحساب بفو لكل ملليلتر. تحقق بعناية من التقاء الخلايا قبل فحص البلاك لضمان أرقام البلاك. بالنسبة لمقايسة ربط الخلايا، أضف ميكروغرامًا واحدًا لكل ميكرولتر من التربسين من بنكرياس بورسين إلى ملليلتر واحد من تعليق الفيروس، ثم قم بدوامة.
تخفيف تعليق الفيروس مع وسيط خال من المصل لضبط وزارة الداخلية إلى بفو واحد لكل خلية. اغسل خلايا MA104 مرتين في لوحة 24-well مع ملليلتر واحد من الملح الملحي المخزنة على تريس. الآن تلقيح الخلايا مع 100 microliters من تعليق الفيروس المخفف في كل بئر من لوحة 24-جيدا.
احتضان لوحة في أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة مع اهتزاز لطيف كل 15 دقيقة. إزالة الفيروس inoculum، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من محلول ملحي tris المخزنة مؤقتا. لاستخراج الحمض النووي المزدوج من فيروس الروتا، إضافة 140 ميكرولترات من 1X PBS و 560 ميكرولترات من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي إلى كل بئر.
تخلط بشكل كاف مع ماصة حتى لا ينظر إلى ضباب الخلايا في المخزن المؤقت. بعد استعادة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وضع أنابيب 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على استخراج الحمض النووي الريبي مزدوجة تقطعت بهم السبل، على كتلة الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لdenature الجيش الملكي النيبالي. ثم ضع الأنابيب على الجليد على الفور واحتضان لأكثر من دقيقتين.
توليف cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي. إضافة أربعة microliters من الحمض النووي الريبي الفيروسية المشوهة إلى أنبوب PCR تحتوي على 16 ميكرولترات من خليط التفاعل، ومزجها بعناية مع ماصة حتى لا تولد فقاعات. بعد الغزل أسفل الأنابيب، أداء النسخ العكسي مع thermocycler.
بالنسبة لل PCR الكمية، استخدم مسبارًا مُدخلًا للوراء يستهدف منطقة 963 إلى 1،049 من جزء الجينوم NSP3 من فيروس الروتا. بشكل متسلسل تخفيف plasmid القياسية مع المياه PCR الصف، والمضي قدما في جعل مزيج الرئيسي لPCR الكمية. إضافة 20 ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى آبار لوحة PCR 96-well.
ثم مزيج خمسة ميكرولترات من عينات cDNA أو خمس ميكرولترات من plasmid القياسية عن طريق الأنابيب 10 مرات. تنفيذ PCR الكمية وفقا للشروط في بروتوكول النص. وأخيراً، احسب جينوم فيروس الروتا المرتبط بسطح الخلية MA104 كما هو موضح في بروتوكول النص.
يظهر هنا منحنى نمو فيروس الروتا. وبتطبيق أقل طريقة مربعة على نموذج غومبرتز المعدل، يقدر معدل النمو المحدد بـ 0.197، وتقدر فترة التأخر بـ 6.61 ساعة. تتر الفيروس النسبي في المرحلة الثابتة إلى تتر الأولي هو 3.15.
ومن بين ست حالات مستنسخة لفيروس الروتا التي تم اختبارها، تراوحت القيم المقدرة لمعدل النمو المحدد بين 0.19 إلى 0.27. هذه القيم المقدرة موثوق بها لأن معامل قيم التحديد في تركيب النموذج أكثر من 0.98. يتم عرض نتيجة مقايسة ربط الخلايا ككفاءة ملزمة ، وهي نسبة الجسيمات الفيروسية المقيدة إلى تلك الموجودة في inoculum.
لدينا RV virions ملزمة لأسطح الخلايا حوالي 10، 000 نسخة لكل ملليلتر مع كفاءة ملزمة من حوالي 1٪عند استخدام لوحة 24-جيدا لمقايسة ربط الخلية. منذ الخلايا المزروعة حساسة للضغوط المادية، والحرص على صب العازلة و agar بلطف ولكن بسرعة. أساسا، تم إدخال نظام جديد للفيروسات.
باستخدام هذا النظام، يمكننا تقييم القدرة الحقيقية لخلية ملزمة ومعدل نمو محدد مع الصكوك. بروتوكولنا مفيد في قياس سمة فينوتيبيك. من خلال التحقق من مختلف السلالات الناشئة حديثا، يمكنك المساعدة في تقييم اللقاحات الجديدة للفيروسات.
يتم تعيين الفيروسات كمسببات للأمراض BSL-2، لذلك سوف تحتاج إلى إعداد غرف تجريبية BSL-2 لتنفيذ هذا الإجراء.
