We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

1. إعداد الخلايا والكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل الفحص، لوحة الخلايا المضيفة المناسبة للفيروس في السؤال (الجدول 1 و 2) بنسبة 90 - 100٪ confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول التثبيت الفورمالين 10٪ في DH 2 O. في المثال، مزيج 5.56 مل من 36٪ مع الأسهم الفورمالديهايد 14.44 مل المقطر H 2 O (DH 2 O). ملاحظة: استخدام ممارسات التعامل الآمن المناسبة والتهوية عند استخدام الفورمالدهايد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكريستال البنفسجي وصمة عار: 1٪ كريستال فيوليت (CV) في 20٪ من الإيثانول ودرهم 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام وحة 2X (نوع من الخلايا تعتمد على تركيز 2X؛ انظر الجدول 2). تصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرون إن وجدت الكواشف ليست عقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تراكب شل حركة (الجدول 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب السائلة، وجعل العقيمة حل 2.4٪ من Avicel في DH 2 O. لمنع تراكمها، إضافة إلى مسحوق قارورة تحتوي على الماء والعشرينفي الاختلاط بسرعة مع شريط ضجة، صب في Avicel ببطء ويقلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT). عندما يثبت الحل لزج جدا بالنسبة بقضيب إلى التجانس، والتحول إلى شاكر قارورة ل&gt; 30 دقيقة مع الإثارة الثقيل لضمان حتى التجانس. ويمكن إجراء الحلول المالية بتركيزات أقل، ولكن الحلول يمكن أن تنفصل، وسوف تحتاج إلى ريمكس لضمان التجانس: ملاحظة. حلول العمل من Avicel يمكن استخدامها تتراوح 0،6-3٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجانس، الأوتوكلاف الحل وتخزين مختومة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للالاغاروز وكاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) تراكب، وإعداد محلول المخزون في DH 2 O 2٪ CMC أو 0.6٪ الاغاروز. خلط مع بقضيب والأوتوكلاف أو الميكروويف لجلب إلى حل. </li></ol></li></ol> 2. التخفيفات والعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم من الطلاء، والتحقق بصريا confluency وقابلية الخلايا قبل بدء الفحص. ضمان قياسي الخلوي التشكل والثانية و~ 90٪ متموجة أحادي الطبقة موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف من العينات المعدية. استخدام وسائط النمو الخلوي لانتشار فيروسي مثل مخفف (الجدول 2). تختلف عدد التخفيفات المطلوبة على أساس عيار المتوقع للفيروس المذكور، ودائما استخدام العينة الضابطة غير المصابة بشكل مستقل لضمان استمرارية الخلوية والمساعدة في تحديد هوية اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من التخفيفات التسلسلية، تصيب الخلايا لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة (الجدول 1). استخدام كمية كافية من اللقاح لتغطية الخلايا، مع الحفاظ على وحدة التخزين عند أدنى مستوى ممكن لتحقيق أقصى قدر من الاتصال الفيروسي مع أحادي الطبقة (الجدول 4). لوحات الروك بلطف كل 20 دقيقة حتى لضمان التغطية ومنع أحادي الطبقة الخلوية من التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصابة، تراكب حجم مناسب من شل حركة المتوسطة مباشرة إلى اللقاح في البئر (الجدول 2) باستخدام 1: 1 مزيج من وسائل الاعلام وحة 2X وimmobilizتراكب الاختيار جي (CMC، الاغاروز أو Avicel). صخرة بلطف لمزج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب السائلة، خلط 1: 1 مع درجة حرارة سائل الإعلام وحة 2X و1،2-2،4٪ الأسهم RT Avicel للحصول على حل العاملة من 0.6-1.2٪ Avicel تراكب المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتراكب الاغاروز، واستخدام 1: 1 خليط من وسائل الاعلام وحة 2X تحسنت وحل الأسهم ساخنة من 0.6٪ الاغاروز، مكان في 56 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة الحصول النهائي تركيز الاغاروز / تراكب 0.3 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لCMC، إعداد محلول المخزون 2٪ وعلاج كما هو موضح في تراكب الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تطبيق تراكب لأحادي الطبقة، تتوازن دائما الاغاروز ساخنة أو CMC في 56 ° C المياه لمنع الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة. ضمان الحل هو دافئ، ولكن ليس الساخن لمسة لمنع موت الخلايا وتقليل التتر الفيروسية. وسوف تبدأ معظم تراكب الاغاروز لترسيخ دون 42 درجة مئوية، ويعمل بسرعة و / أو إعداد دفعات صغيرة لمنع تصلب أثناء التعامل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إضافة تراكب، واحتضان لوحات لانتاج اللوحات المتميزة التي هي بوضوح معدودة. تشكيل لوحة يمكن أن يستغرق 2-14 أيام تبعا للفيروس التي يجري تحليلها، الجدول 1. ملاحظة: عندما يتم وضع لوحات مضافين السائلة في الحاضنة، لا تتحرك لهم. وحركة تراكب السائلة خلال فترة الحضانة يؤدي إلى ويحات طخت. الاغاروز وتراكب CMC هي نصف صلبة ويمكن نقلها أو فحص دوري تحت المجهر الضوئي لمراقبة وضع اللوحة. </li></ol> 3. إصلاح الخلايا وتلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصلاح الخلايا، صب قبالة أو نضح تراكب Avicel، وإصلاح الخلايا باستخدام محلول الفورمالديهايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة ليلة وضحاها (&lt;1 مل لكل بئر لمدة 6 لوحة جيدا). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالاغاروز أو CMC، إضافة محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى تراكب لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها. ملاحظة: يمكن أن تظل عينات لفترات طويلة من الزمن في تثبيتي، بشرط أن تفعللا تتبخر وتجف وهذا يمكن أن تشوه أحادي الطبقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تلطيخ وبعد التثبيت، تجاهل الفورمالديهايد وإزالة شمعات نصف صلبة للالاغاروز وCMC مع أي مياه جارية أو يدويا مع ملعقة. شطف ويحات Avicel بالماء لإزالة بقايا تراكب / تثبيتي قبل تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتلطيخ، وتغطي الخلايا مع الحد الأدنى من الكريستال البنفسجي حل ل~ 15 دقيقة. لوحات صخرية إذا لزم الأمر لضمان حتى التغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بلطف وصمة عار الكريستال البنفسجي بالماء. مرة واحدة ثابتة، والملون، وتجفيفها وتخزينها لويحات إلى أجل غير مسمى لتحليل المستقبل. </li></ol> 4. تحديد التتر الفيروسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد لويحات في كل بئر، مع متوسط ​​مكررات أي تقنية من نفس التخفيف. لتنسيقات لوحة كبيرة والآبار خصم مع أقل من 5 أو أكثر من 100 لوحات. يحيط علما حجم اللوحة والتشكل. يجب أن يكون الشاهد السلبي أحادي الطبقة موحدة ويمكن استخدامه كجهاز تحكم المرجعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عيار الفيروسية من العينة الأسهم عن طريق أخذ متوسط ​​عدد لويحات لتخفيف ومعكوس عامل التخفيف الكلي. </li></ol><img alt="المعادلة 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> ملاحظة: وعلى سبيل المثال، 30 و 32 لويحات أحصت لمكررات من 1 × 10 -7 التخفيف [31 (المتوسط) / 10 -7 (التخفيف) × 0.4 مل (اللقاح)] أن تسفر عن عيار 7.75 × 10 8 PFU / مل.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

العامل الأكثر أهمية لفحص اللوحة الناجح يكمن في تعظيم الاستفادة من بروتوكول للثقافة فيروسية معينة في السؤال عن الظروف يمكن أن تختلف بشكل كبير. النقاط الرئيسية لتأخذ في الاعتبار هي: استضافة التوافق الخلوي مع الفيروس في السؤال، وظروف النمو المناسبة الفيروسية، نطاقات تخفيف كافية من أجل التفريق بوضوح لويحات، واختيار تراكب الصحيحة وتلطيخ للخلايا وفيروس المعنية. بينما VEEV وRVFV كلا تنمو في ظل ظروف مشابهة جدا استخدام العديد من نفس أنواع الخلايا المضيفة، والاختلافات في البلاك التشكل والنمو حركية تختلف بشكل كبير. عند استخدام خلايا فيرو لفحوصات لوحة، والتي جرت العادة على استخدامها كخط خلية نشر ومؤشر للحمى النزفية الفيروسات وalphaviruses، VEEV ينمو عادة إلى التتر أعلى من RVFV ويوضح زيادة حركية تكرار وتطوير لويحات كبيرة موحدة في 48 HPI 4، 10-12. وعلى النقيض من VEEV، يتطلب RVFV 72 HPI ويبين اللوحات التي عادة ما تكون أصغر بكثير في الحجم ومتغير. في المعارضة لRVFV وVEEV، فيروس الانفلونزا هو غاية الخلية المضيفة محددة، ويمكن أن يكون من الصعب نشر من خلال زراعة الأنسجة. لفيروس الإنفلونزا، وبدأ دخول الفيروس والانصهار عادة عن طريق ربط مستقبلات سطح الخلية التي تحتوي على بروتين سكري hamagglutinin الفيروسية (HA)، التي تتوسط الدخول إلى الخلية المستهدفة من خلال الربط مع α اللعابي مستقبلات حمض سطح الخلية المضيفة. ها هو بروتين سكري مثلوثي التي هي موجودة في الغشاء المغلف للجميع فيروسات الأنفلونزا ويتطلب الانقسام في HA1 مفارز وHA2 من قبل البروتيني الخلية المضيفة محددة. لمزيد من تعقيد المسألة، يمكن لهذه المواقع انشقاق في كثير من الأحيان تختلف بين سلالات فيروسية 13. كتعبير عن البروتياز القادرة على الشق HA يقتصر على أنسجة معينة، البروتياز عه غالبا ما تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية من أجل تسهيل اندماج فيروسي ودخول الخلية المضيفة اختيار 13. TPCK-التربسين هو مثال واحد من البروتيني المستخدمة عادة يستخدم في زراعة الخلايا مع كل MDCK وخلايا فيرو: تسهيل النسخ المتعددة دورة (في غياب أي التربسين تعطيل المصل) من خلال تنشيط بروتين من فيروس HA 14،15. كما هو موضح في هذه الدراسة وغيرها، يمكن أن الاختلافات في دورات الحياة الفيروسية تؤثر اختيارات تراكب، صيغ لوحة، وأوقات جمع، مع الفروق الكبيرة بين الطبقات المختلفة وأنواع من الفيروسات. في دراستنا، أظهرت تراكب الاغاروز ويحات أكثر وضوحا في التتر أعلى من أي CMC أو تراكب السائلة لكلا RVFV وفيروس الأنفلونزا B، يعزز فائدتها من بين مجموعة واسعة من الفيروسات وأنواع الخلايا. باستخدام تركيز النهائي انخفاض الاغاروز ساعد الى حد كبير في إزالة شمعات الصلبة وتلطيخ مبسط. أظهرت CMC عموما عoorest فعالية كإضافة لجميع الفيروسات الثلاثة اختبارها وإنتاجها لويحات صغيرة جدا وغير واضحة لفيروس الأنفلونزا (ب). على الرغم من أن مجمل CMC أثبت أقل الخصائص المرغوبة، واستخدامه في النمو السريع للغاية وفيروسات خبيثة قد تثبت فائدة، كما فعلت يبدو لتقليل حجم الترسبات مع وجود انخفاض في الحد الأدنى من عيار. أثبت تراكب السائل أن تكون أكثر تنوعا من حيث أنها كانت بسيطة للغاية لإعداد، وزيادة سهولة الاستخدام، وكان تعادل الاغاروز عبر كافة الفيروسات المحدد. في شكل لوحة إنتاجية أعلى 96 بئرا، وتطبيق وإزالتها لم يكن مستعمل بسبب التصلب كما هو الحال مع تراكب التقليدية، وتقدم نتائج دقيقة ومتسقة. وهناك اعتبار عند استخدام تراكب السائلة يكمن في التلوين مبهمة وعدم القدرة على مراقبة تشكيل لوحة لا يمكن أن يتم نقل الصفائح حتى نقطة جمع، مما يحد هذا التكيف للفيروسات مع حركية تكرار تتميز سابقا. <pالطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; تعديلات طفيفة في ظروف فحص اللوحة يمكن أن يغير بشكل كبير على النتائج، وهناك ما يبرر دائما تقييم وأداء أي نظام جديد أو تقنية. في حين لا وجود بروتوكول فحص اللوحة الأمثل وموحد لكل حالة، تقريرنا يظهر براعة وسهولة الاستخدام في التقليدية، فضلا عن تراكب سائل جديدة لفحوصات لوحة، في الوقت الذي توفر خلفية كافية لمزيد من التعديلات المستخدم.

وقد تم عزل دقيقة والكمي للعينات فيروسية قابلة للحياة على الدوام هدفا البحوث الجارية في علم الفيروسات. لم يكن حتى مجيء فحص اللوحة في عام 1952 أن وسيلة للكميا ونوعيا حساب التتر الفيروسية الحيوانية وقد تم تطوير أول 1،2. وقد تم تكييف هذه التقنية لأول مرة وتعديلها من المقايسات فج، والتي سبق استخدامها لحساب التتر من البكتيريا الأسهم في بيولوجيا النبات 1،2. في حين أن وسائل بديلة للالكمي الفيروسي ومنذ ذلك الحين تم تطويرها وتكييفها، مثل المناعية، ومضان المجهر الإلكتروني انتقال، الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني)، التدفق الخلوي، وأنظمة مراسل المؤتلف، والعكس الكمي سلسلة البوليميراز رد فعل النسخ (QRT-PCR) ، تفشل هذه الأساليب لتحديد وquantitate تكرار virons المختصة 1،3. بينما تستمر التقدم في التكنولوجيات والتقنيات لتحسين وتغيير المناظر الطبيعية؛ plaquتستمر المقايسات البريد لتمثيل معيار الذهب في تحديد تركيزات الفيروسية المعدية للvirons التحللي 1،4. خلال فحص اللوحة، مصاب أحادي الطبقة متموجة من الخلايا المضيفة مع فيروس التحللي من تركيز معروف الذي تم تخفيفه بشكل متسلسل لمجموعة معدود، وعادة ما بين 5-100 virions. ثم يتم تغطية الطبقات الوحيدة المصابة مع وسيلة تراكب مستوقف لمنع العدوى من الانتشار الفيروسي بشكل عشوائي إما من خلال تدفق الميكانيكية أو التضاريسية للوسط السائل خلال انتشار الفيروس. في حين تراكب صلبة أو نصف صلبة مثل الاغاروز، السليلوز الميثيل أو كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) وقد جرت العادة على استخدامها، أصبحت تراكب السائل بديلا جذابا بشكل متزايد مع تطور تراكب سائل جديدة مثل Avicel 5- 7. المقايسات البلاك باستخدام السائل مقابل تراكب التقليدية تتمتع بالعديد من المزايا مثل تراكب يمكن أن يكون تطبيق ورقةالعبوات الناسفة في درجة حرارة الغرفة، وتطبيق وإزالة أسهل بكثير. كما تراكب السائلة لا تحتاج الاحترار، قد الفيروسات عطوب الحرارة حساسة ويثبت أيضا أسهل لوحة. بعد الإصابة الأولية وتطبيق تراكب مستوقف، لويحات الفردية، أو مناطق من موت الخلايا، سوف تبدأ في تطوير مقيدة عدوى فيروسية كما والتكرار إلى أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف تستمر الخلايا المصابة دورة النسخ المتماثل تحلل العدوى، مما يضخم العدوى، مما أدى لويحات متزايد متميزة ومنفصلة. اعتمادا على حركية النمو والخلايا الفيروسية المضيف المستخدمة، وتشكل لوحة مرئية عادة في غضون 2-14 أيام. يمكن بعد ذلك عد الطبقات الوحيدة الخلوية مع المجهر حقل مشرق القياسية، أو أكثر عادة ثابتة و counterstained بواسطة محايدة أحمر أو الكريستال العنيف من أجل تحديد بسهولة لويحات بالعين المجردة. هناك طائفة واسعة من البقع مكافحة البلاك المتاحة، كل تقدم والعشرينمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو مزايا وعيوب محددة. وعادة ما يضاف الكريستال البنفسجي عند نقطة جمع وبعد تثبيت / إزالة تراكب، وتوفير وصمة عار المضادة السريعة والمتميزة التي تسمح بتحديد لويحات صغيرة جدا عندما التشكل المختلط الحالي. محايد الأحمر في الاستفادة من التطبيق المبكر واتصال دائم مع تراكب، والسماح للرصد المباشر لوضع تشكيل اللوحة، والتي هي مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الفيروس أو النسخ غير معروفة حركية. ومع ذلك فقد وجدنا أن تلطيخ عادة لا متميز كما عند استخدام أحمر محايد. 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) نتروبلو بروميد -2،5-ثنائي الفينيل (الإنتقالي العسكري) ويقدم العديد من المزايا، مثل البقع الصفراء الصبغة الملونة خلايا يمكن الاعتماد ويحات زرقاء داكنة والفيروسية دون إزالة التراكب مثلما يعيش مع أحمر محايد. التباين الكبير بين الخلايا الحية والميتة التي يوفرها الإنتقالي العسكري أيضا يسمح للكشف عن لويحات صغيرة في وقت سابق إصابة آخر نقطة، على الرغم من أن التخزين لا تزال تتطلب إزالة تراكب 8. كما وضوح الشمس فوق البنفسجية يمكن أن يتم ببساطة في محلول من الماء والكحول، ويوفر درجة عالية من الحساسية لوحة التشكل مختلطة، اخترنا أنها مضادة المفضلة ومبسطة وصمة عار لبروتوكول تظاهر لأننا باستخدام عدة عائلات جيدا ومن أهم خصائص فيروسات. بعد تحديد وتلطيخ أحادي الطبقة الخلوية المصابة، يتم عدها لويحات من أجل عيار العينات الفيروسية الأسهم من حيث تشكيل وحدات لوحة (PFU) في الملليمتر الواحد. وتجدر الإشارة إلى انخفاض سجل بين التخفيفات التسلسلية و، اعتمادا على حجم لوحة، بين 5-100 لويحات عدها، مع سيطرة سلبية استخدامها كمرجع. وتختلف عينات إحصائية بنسبة 10٪ لكل 100 ويحات تحسب عند مقارنة عينة يعيد 3. ميزة استخدام المقايسات لوحة لتحديد التتر الفيروسية تكمن في قدرتها ل quantitate العدد الفعلي من الجسيمات الفيروسية المعدية ثithin العينة. كما virions متعددة يحتمل أن تصيب خلية واحدة، يتم استخدام المصطلحات الوحدات مقابل virons خلال المعايرة البلاك 1،2. مورفولوجيا الترسبات يمكن أن تختلف بشكل كبير في ظل اختلاف ظروف النمو وبين الأنواع الفيروسية. وتجدر الإشارة إلى حجم كل لوحة، الوضوح، تعريف الحدود، والتوزيع لأنها يمكن أن توفر معلومات قيمة عن النمو وعوامل الفوعة للفيروس في السؤال. ويمكن أيضا المبادئ الأساسية فحص اللوحة تكييفها وتعديلها في عدد من الطرق المختلفة، مثل استخدام التركيز تشكيل المقايسات (FFAs). FFAs لا تعتمد على تحلل الخلايا وcounterstaining للكشف عن تشكيل لوحة، وإنما توظف تقنيات للكشف عن البروتينات الفيروسية داخل الخلايا مباشرة من خلال الأجسام المضادة المناعية ذات الكلمات الدلالية. زيادة الحساسية، وانخفضت مرة الحضانة بعد الإصابة، والأهم من ذلك القدرة ل quantitate الفيروسات غير التحللي كلها متميزةمزايا عندما توظف FFAs. في حين تستخدم على نطاق واسع، فإن العوامل التي تحد حاسمة في FFAs مقابل فحص اللوحة التقليدية تكمن في الحاجة إلى الأجسام المضادة المناسبة والقدرة على تحقيق الوحيد للمفارز البروتين الفيروسية المعدية الفعلية مقابل virons 4. لغرض هذه الدراسة، فإننا سوف تحد من مناقشتنا لفحوصات وحة الكلاسيكية ووصف استخدام أغطية صلبة ونصف صلبة التقليدية (الاغاروز وCMC)، جنبا إلى جنب مع رواية الجريزوفولفين السائل تراكب السليلوز.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

تبقى المقايسات البلاك إحدى الطرق الأكثر دقة لتقدير المباشر لvirons المعدية والمواد المضادة للفيروسات من خلال عد لويحات منفصلة (الوحدات المعدية والمناطق الميتة الخلوية) في زراعة الخلايا. نحن هنا لشرح كيفية إجراء فحص اللوحة الأساسية، وكيفية تراكب وأساليب متباينة يمكن أن تؤثر على تكوين البلاك والإنتاج. عادة ركائز صلبة أو نصف صلبة تراكب، مثل الاغاروز أو كاربوكسيميثيل السليلوز، وقد استخدمت لتقييد انتشار الفيروس ومنع العدوى من خلال العشوائي وسط النمو السائل. تراكب يجمد تقيد العدوى الخلوي لأحادي الطبقة المحيطة بها فورا، والسماح للتشكيل بؤر معدود منفصل وتشكيل لوحة لاحق. للتغلب على الصعوبات الكامنة في استخدام تراكب التقليدية، تراكب السائل رواية باستخدام السليلوز الجريزوفولفين والسليلوز carboxymethyl الصوديوم قد استخدمت على نحو متزايد كبديل في مستوىفحص اللوحة. السائلة المقايسات لوحة تراكب يمكن أن يؤديها بسهولة في أي معيار 6 أو 12 صيغ لوحة كذلك في الأساليب التقليدية، ويتطلب أي معدات خاصة. نظرا إلى حالته السائلة وسهولة اللاحقة من تطبيق وإزالتها، يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم صيغ لوحة ثقافة صغرى كبديل الإنتاجية سريع ودقيق ورفيع إلى المعايرة الفيروسية نطاق أوسع. استخدام السائل اللزج ساخنة البوليمر عدم توفر الفرصة لتبسيط العمل، وتحافظ على الكواشف، الفضاء الحاضنة، وزيادة السلامة التشغيلية عند استخدامها في مختبرات الاحتواء التقليدية أو عالية كما لا التدفئة كاشف أو الأواني الزجاجية مطلوبة. تراكب السائلة قد تكون أيضا أكثر حساسية من تراكب التقليدية للحرارة بعض الفيروسات عطوب.

قدرة المقايسات البلاك إجراء تقييم دقيق التتر الفيروسية تعتمد على العديد من العوامل: اختيار الخلية المضيفة مناسبة، وسائل الإعلام المناسبة وظروف النمو للبقاء الخلوية والفيروسية، انتشار فيروسي يجمد، وتحديد دقيق للفترة حضانة الفيروس لإتاحة الوقت الكافي للمتميزين وتشكيل لوحة معدود. لهذه الدراسة، تم اختيار ثلاث عائلات من الفيروسات التمثيلية لإظهار الاختلافات في: اختيار تراكب، وفترات الحضانة، والتشكل عبر البلاك اختلاف أنواع العينة. وقد تم اختيار الفنزويلي التهاب الدماغ الخيلي (VEEV) كنموذج الفيروسي (+) ssRNA، الذي يمكن أن يسبب مرض كبير في أنواع الخيول والبشر ويمثل عائلة الفيروسات الطخائية. الإنفلونزا ب تايوان سلالة، وهي مجزأة (-) فيروس ssRNA إصابة البشر في المقام الأول، يمثل عائلة فيروسات مخاطية قويمة. فيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)، وهي (-) المفصلية ssRNA ولد فيروس يصيب في المقام الأول المفصليات،الحيوانات المجترة والبشر اختير، بصفته ممثلا لعائلة الفيروسات البنياوية. لRVFV (الشكل 1)، تم تحديد التتر من محلول المخزون من سلالة الحي الموهن MP12 المؤتلف من RVFV في شكل 12 لوحة جيدا باستخدام CMC، الاغاروز، أو تراكب Avicel التي حضنت جنبا إلى جنب للعدوى بعد 72 ساعة (HPI). وهناك لوحة تمثيلية تظهر التخفيفات تتراوح بين 10 إلى 10 -4 -7 يمكن رؤيتها في لوحة A. اللوحات باستخدام CMC وأظهر تراكب الاغاروز ويحات صغيرة، واضحة، ومميزة مع الحدود دائرية واضحة المعالم. كانت لويحات مع تراكب السائل قليلا أكثر وفرة وأكبر بالمقارنة مع الاغاروز وويحات CMC، وفرت الحدود أقل متميز. وتمت مقارنة التتر الفيروسية في لوحة ب مع كل من تراكب أداء نسبيا. من أجل الحصول على المقارنة البصرية أكثر وضوحا بين تراكب لMP12 جنبا إلى جنب مع أكبر حجم العينة لتحديد reproducibility، تم محاكمتهم لوحة 6 جيدا أيضا في ثلاث نسخ (الشكل 2). في شكل لوحة 6 جيدا، وأظهر استخدام تراكب CMC ويحات أصغر من أي تراكب الاغاروز أو السائلة، والتي كانت مماثلة في الحجم لبعضها البعض. في حين أن التتر الفيروسية مماثلة بين جميع تراكب ثلاثة (لوحة D)، لويحات تشكلت في تراكب الاغاروز والسائلة أثبتت أسهل على الاعتماد بسبب زيادة حجمها. في تناقض مع RVFV، التتر VEEV ومورفولوجيا الترسبات بين تراكب مختلفة تفاوتت بشكل ملحوظ (الشكل 3A). وأظهرت اللوحات التي تشكلت في تراكب CMC مورفولوجيا واضح ومتميز عند استخدام شكل لوحة الآبار 12، على حساب حجم اللوحة وحساسية (لوحة باء). وعلى النقيض من CMC، أدى استخدام الاغاروز والسائلة تراكب في لويحات أكبر بكثير، مشيرا إلى انخفاض تثبيط الفيروس وزيادة الحساسية للVEEV النسخ المتماثل. وقد تأكد هذا في السابق عند مقارنة فقط الاغاروز مقابل CMC في APأبر نشرتها خواريز وآخرون. 4. بينما أنتجت الاغاروز والسائلة تراكب ويحات أكبر من CMC، كان لويحات تعريف سيئة الحدود وكان من الصعب الاعتماد في شكل جيد 12، مع تراكب السائلة توفير أكبر انتشار الحدود. عندما تم محاكمتهم لويحات في 6 لوحات جيدا (الشكل 4)، نفي أكبر شكل جيد 6 القضية لويحات كبيرة بشكل علني التي كان من الصعب التفريق في شكل 12 أيضا، مع الاغاروز وتراكب السائلة تثبت متفوقة على تراكب CMC من حيث تعريف البلاك وبحساسية (الشكل 4D). بالمقارنة مع RVFV أو VEEV، يوفر أنفلونزا عدة تحديات فريدة من نوعها عندما plaquing، مثل شرط وجود الأنزيم البروتيني الخارجي. حساسية فيروس الأنفلونزا لاختلاف الاختيارات تراكب كما تم توثيقه جيدا في الماضي وقد لوحظت تغييرات كبيرة عندما تعديلات طفيفة مثل الماركات المختلفة من الاغاروز لها أن تكونأون تستخدم 9. ومن المثير للاهتمام للسلالة الأنفلونزا ب تايوان، أدى استخدام CMC كما تراكب في لويحات صغيرة بشكل ملحوظ التي كان من الصعب الاعتماد وثبت صعوبة ليسجل موثوق (الشكل 5A). وفر استخدام تراكب الاغاروز أفضل لويحات (لوحة C)، ونتج عن ذلك وصمة عار قتامة الخلفية (بسبب الأرجح إلى زيادة قابلية أحادي الطبقة)، وأظهرت اللوحات أكثر وضوحا وأكثر وضوحا في مقارنة مباشرة لاستخدام تراكب السائل (لوحة ب ). وهناك ميزة واضحة من البوليمرات السائلة على مدى تراكب صلبة ونصف صلبة، مثل الاغاروز وCMC، يكمن في سهولة إزالة والتطبيق. تراكب شبه الصلبة تتطلب التدفئة، والتصلب يمكن أن يثبت عند التعامل مع إشكالية وإزالة. من أجل الاستفادة من هذه المزايا وتحديد العملية لاستخدام Avicel بطريقة عالية الإنتاجية للRVFV، تم محاكمتهم شكل لوحة الآبار 96 في متفاوتة concentrati تراكبإضافات (الشكل 6). لRVFV MP-12، وأجريت التخفيفات في quadruplicate في كلا 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel. ثبت تطبيق تراكب وإزالة بسيط، مع عدم وجود اختلافات واضحة بين مكررات أو بين تجمعات لوحظ، مما يدل على درجة عالية من التكاثر. عندما التهديف، كانت لوحات متميزة والمعدودة للعين المجردة، مما يدل على جدوى استخدام تراكب السائل بطريقة إنتاجية عالية للRVFV. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> الرقم 1: RVFV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC (ج النهائيةoncentrations)، تم تطبيقها من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> الشكل 2: RVFV وحة مقارنات تراكب باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. تراكب ثلاثة مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A، أجريت B، و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات AC، مع ويحات أحصت وtitered في لوحة D (N = 3). <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> الرقم 3: &lt;قوية&gt; VEEV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة. تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من سلالة اللقاح VEEV TC-83. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> الرقم 4: V EEV مقارنات تراكب اللوحة باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من VEEV TC-83. بعد الإصابة، 3 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو CMC 1٪، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضحفي لوحات A، أجريت B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3). <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> الرقم 5: الأنفلونزا وحة مقارنات تراكب كانت مطلية خلايا MDCK في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من الأنفلونزا ب تايوان. تم استخدام أي مصل بقري جنيني (FBS) في وسائل الإعلام أو تراكب النمو، كما FBS يمكن أن تمنع انتشار الأنفلونزا من خلال تثبيط بعض البروتياز التي مطلوبة من أجل الانصهار الفيروسي. تمت إضافة TPCK-التربسين لجميع تراكب قبل التطبيق من أجل تسهيل اندماج فيروسي والدخول مع الخلايا المضيفة. بعد الإصابة، تم تطبيق تراكب 3 مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC من أجل مقارنة مباشرةنفذت تراكب كما هو موضح في لوحة A، B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح في لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3). بينما اتخذ في المتوسط ​​لويحات CMC ثبت من الصعب الاعتماد بشكل موثوق لأنها أثبتت الحدود منتشر والأحجام وحة صغيرة جدا. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> الرقم 6: تراكب اللوحة عالية الإنتاجية و96 لوحة جيدا من Veros مطلي في 3 × 10 4 خلايا لكل بئر، كانت مصابة 50 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من RVFV MP12 لمدة 1 ساعة، في quadruplicate. لتراكب، تم محاكمتهم 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel من أجل تحديد الجدوى واستنساخ باستخدام تراكب السائلة بطريقة عالية الإنتاجية، لوحات A و B. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> فترة العدوى </td><td> 1 ساعة </td><td> 1 ساعة </td><td> 45 دقيقة </td></tr><tr><td> فترة حضانة </td><td> 3 أيام </td><td> 2 أيام </td><td> 3 أيام </td></tr></tbody></table> الجدول 1: البلاك الفحص التلقيح شروط والخلية أنواع <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> نوع النمو</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> اللوحة الإعلام </td><td> 2xEMEM و </td><td> 2xEMEM و </td><td> 2xEMEM ب </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين. 2. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين، 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 0.025٪ HEPES، DEAE-دكستران 50ug / مل. A. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 5٪ FBS (25 مل)، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، و 1٪ البيروفات الصوديوم (5 مل)، 1٪ L-الجلوتامين (5 مل)، 2٪ القلم / بكتيريا (10 مل). B. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، 50ug / مل، 0.025٪ HEPES، DEAE-ديكستران، التربسين-TPCK * * فقط قبل التحضير، إضافة 1 ميكرولتر لكل 25مل من 2 ميكروغرام / مل من الأسهم TPCK-التربسين إلى قسامة سوف تستخدم لخلط مع الاغاروز لويحات. الجدول 2: اللوحة والفيروسية / الخليوي الأوساط النمو <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> الإنفلونزا ب </td></tr><tr><td> نوع من الخلايا </td><td> فيرو </td><td> فيرو </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> فترة العدوى </td><td> 1 ساعة </td><td> 1 ساعة </td><td> 45 دقيقة </td></tr><tr><td> فترة حضانة </td><td> 3 أيام </td><td> 2 أيام </td><td> 3 أيام </td></tr></tbody></table> سوف حلول تراكب لا تنتهي عندما قام طالما يتم الحفاظ على العقم. الجدول 3: تراكب المالية <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 6 جيدا </td><td> 12 جيدا </td><td> 96 جيدا </td></tr><tr><td> # الخلايا / جيد </td><td> 5 × 10 5 </td><td> 2.5 × 10 5 </td><td> 3 × 10 4 </td></tr><tr><td> حجم innoculum (ميكرولتر) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> حجم تراكب (مل) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: تنسيقات بلايت

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.2K Views.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

نوع التحاليل الكمية للجميع الأنفلونزا من Hemagglutinins الفيروسية وNeuraminidases باستخدام الاجسام المضادة العالمي في فتحة بسيطة فحوصات لطخة

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

باستخدام تراكب الفحص لقياس نوعيا الإنتاج الجرثومي من والحساسية للالرئوية Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.