Используя представленные здесь анализы, можно оценить разницу в фенотипе среди штаммов ротавируса, где единичные штаммы изолированы. В частности, исследована фенотипическая смена дезинфицирующих штаммов ротавируса. Для достижения четких количественных результатов с помощью анализа бляшек крайне важно выбрать соответствующую комбинацию штамма ротавируса и сыворотки, в которой ротавирус хорошо приспособлен к сыворотке.
Демонстрацией процедуры будет Сюн-суке Кадойя, докторант моей лаборатории. Удалите CryoTube, содержащий линии клеток MA104, из контейнера с жидким азотом. Поместите CryoTube в водяной бане при 37 градусах по Цельсию, чтобы разморозить клетки.
Добавьте один миллилитр клеточной суспензии в 20 миллилитров сывороткосодержащей среды в колбе T75. Инкубировать колбу в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2 в течение двух-трех дней. После того, как монослой клетки достигает 80% слияния, удалить супернатант и мыть клетки дважды с пятью миллилитров 1X Dulbecco в PBS.
Добавьте четыре миллилитров 0,05%трипсина-ЭДТА в колбу и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы отделить клетки от колбы. Перенесите подвеску клетки в 15 миллилитровую трубку и центрифугу при 190 г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулированное клеток в один миллилитр сыворотки, содержащей среду.
Затем разбавить повторно сложенные клетки 100 раз со средой. Добавьте три миллилитров разбавленной клеточной суспензии к каждому хорошо из шести-хорошо пластины для налета анализа. Добавьте один миллилитр разбавленной клеточной суспензии к каждому колодец 24-хорошо пластины для клеточного связывания анализа.
Инкубировать пластины в инкубаторе при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре в течение двух-трех дней. Перенесите трубку, содержащую один миллилитр вирусной суспензии в безотхивной среде, из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию в водяную баню при температуре 37 градусов по Цельсию для оттаивания. Добавьте один микрограмм на микролитр трипсина из свиной поджелудочной железы в один миллилитр вирусной суспензии, а затем вихрь.
Инкубация вирусной суспензии при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре в течение 30 минут. Разбавить активированную вирусную суспензию без сыворотки среды для регулировки множественности инфекции, или МВД, до 0,1 пфу на клетку. Добавьте один миллилитр разбавленной вирусной суспензии в клетки MA104 в колбе T75 через три дня после покрытия клеток.
Инкубировать клетки с вирусом при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа, мягко встряхивая колбу каждые 15 минут. Затем добавьте 30 миллилитров среды без сыворотки, содержащей четыре микрограмма на миллилитр трипсина из свиной поджелудочной железы в колбу. Инкубировать колбу при 37 градусах цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре.
Соберите один миллилитр супернатанта в колбе при нуле, шесть, 12, 18, 24 и 36 часов после инфекции, и замените супернатант в 1,5 миллилитров типах с помощью пипетки. Провести цикл замораживания-оттепели в течение 15 минут при температуре минус 80 градусов по Цельсию с последующим 15-минутным таянием на водяной бане при температуре 37 градусов по Цельсию. Затем центрифуга труб при 12 600 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Соберите супернатанта. Фильтр supernatant с дистиллированной 0,2 микрон фильтр для удаления фракции клеток. Храните супернатант при температуре минус 80 градусов по Цельсию до нанесения его на налет для измерения вируса titer.
Когда готовы выполнить налет анализа, поместите трубки, содержащие собранные supernatant в водяной бане при 37 градусов по Цельсию. Добавьте трипсин в один миллилитр 10-кратного разбавленного образца и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Во время этой 30-минутной инкубации тщательно промыть клетки MA104 в шести-хорошо пластины с двумя миллилитров 1X PBS после удаления сыворотки, содержащей среды.
Серийно разбавляют инкубированные образцы средой без сыворотки и прививают по миллилитр разбавленного образца в каждую колодец. Инкубировать пластину в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 недостаточнонасыщенном паре, нежно встряхивая пластину каждые 15 минут. После инкубации снимите инокулум с шести-хорошо пластины.
Добавьте четыре микрограмма на миллилитр трипсина в подготовленную среду. Аккуратно, но сразу же добавить три миллилитров среды смешивается с агарозным гелем для каждого хорошо. Разрешить агарозный гель затвердеть при комнатной температуре в течение более 10 минут.
Затем инкубировать пластину в течение двух дней при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2 недостаточнонасыщенных паров. Затем добавьте один миллилитр 0.015%Нейтральный красный раствор, разбавленный 1X PBS к каждой хорошо, и инкубировать с теми же условиями. Удалить краситель через три часа и продолжать инкубировать в течение одного дня.
На следующий день подсчитайте количество бляшек в каждой пластинке и рассчитайте пфу на миллилитр. Тщательно проверьте слияние клеток до анализа бляшки, чтобы убедиться в количестве бляшек. Для клеточного анализа добавьте один микрограмм на микролитр трипсина из свиной поджелудочной железы в один миллилитр вирусной суспензии, а затем вихрь.
Разбавить вирусную суспензию средой без сыворотки, чтобы настроить МВД до одного пфу на клетку. Вымойте клетки MA104 дважды в 24-хорошо пластины с одним миллилитр трис-буфера солевого раствора. Теперь привить клетки 100 микролитров разбавленной вирусной суспензии в каждый колодец 24-хорошо пластины.
Инкубировать пластину при четырех градусах по Цельсию в течение 90 минут с нежной тряской каждые 15 минут. Удалить вирус inoculum, и мыть клетки в два раза с одним миллилитр трис-буфера солевого раствора. Для извлечения двухструйной РНК ротавируса добавьте в каждую колодец 140 микролитров 1X PBS и 560 микролитров буфера извлечения РНК.
Смешайте адекватно с пипеткой, пока дымка клеток в буфере не видел. После восстановления двухместной РНК, в соответствии с протоколом производителя, поместите 1,5 миллилитровые трубки, содержащие двухструйный экстракт РНК, на тепловом блоке при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, чтобы денатуратура РНК. Затем сразу же поместите трубки на лед и инкубировать в течение более двух минут.
Синтезировать cDNA с помощью комплекта обратной транскрипции. Добавьте четыре микролитров денатурированного вирусного РНК-раствора в трубку ПЦР, содержащую 16 микролитров реакционной смеси, и тщательно смешайте ее с пипеткой, чтобы не генерировать пузырьки. После вращения вниз по трубам, выполнить обратную транскрипцию с термоциклером.
Для количественного ПЦР используйте зонд, вставленный в утоление, ориентированный на область 963 к 1049 сегмента ротавируса генома NSP3. Серийно разбавить стандартную плазмиду с ПЦР-класса воды, и приступить к сделать мастер смесь для количественных ПЦР. Добавьте 20 микролитров мастер-микса к колодцам 96-колодец ПЦР пластины.
Затем смешайте пять микролитров образцов кДНК или пять микролитров стандартной плазмиды, трубя 10 раз. Выполняем количественный ПЦР в соответствии с условиями текстового протокола. Наконец, вычислите геном ротавируса, связанный с поверхностью клетки MA104, как описано в текстовом протоколе.
Здесь показана кривая роста ротавируса. Применяя наименее квадратный метод к модифицированной модели Гомперца, конкретные темпы роста оцениваются в 0,197, а период отставания оценивается в 6,61 часа. Относительный вирус titer на стационарной фазе к первоначально titer 3.15.
Из шести проверенных клонов ротавируса оценочные значения конкретных темпов роста варьировались от 0,19 до 0,27. Эти оценочные значения являются надежными, поскольку коэффициент значений определения в примерке модели составляет более 0,98. Результатом клеточно-связывающего анализа отображается как связывающая эффективность, которая представляет если соотношение связанных вирусных частиц и частиц, присутствующих в инокуле.
Наша привязка RV virions к поверхностям клеток составляет около 10 000 копий на миллилитр с связывающей эффективностью около 1%при использовании пластины из 24 колодец для анализа связывания клеток. Так как культивируемые клетки чувствительны к физическим нагрузкам, позаботьтесь, чтобы залить буфер и агар мягко, но быстро. По существу, была введена новая система для вирусов.
Используя эту систему, мы можем оценить реальную способность связывания клеток и конкретные темпы роста с помощью инструментов. Наш протокол выгоден в измерении фенотипической черты. Проверяя различные новые штаммы, вы можете помочь оценить его новые вакцины для вирусов.
Вирусы обозначены как патогены BSL-2, поэтому вам нужно будет подготовить экспериментальные помещения BSL-2 для выполнения этой процедуры.
