Burada sunulan tahliller kullanılarak, benzersiz suşların izole edildiği rotavirüs suşları arasındaki fenotip farkı değerlendirilebilir. Özellikle, rotavirüs dezenfektan dirençli suşların fenotik değişiklik araştırılır. Plak tahlilini kullanarak net kantitatif çıktılar elde etmek için, rotavirüs seruma iyi adapte olduğu uygun bir rotavirüs suş ve serum kombinasyonunu seçmek önemlidir.
Prosedürü gösteren Syun-suke Kadoya, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak. Sıvı nitrojen kabından MA104 hücre hatları içeren bir CryoTube'u çıkarın. Hücreleri eritmek için CryoTube'u 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin.
Bir T75 şişesinde serum içeren ortamın 20 mililitresine bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesine ve %5 CO2'ye 2-3 gün kuluçkaya yatırın. Hücre monolayer% 80 birleşimi ulaştığında, supernatant çıkarın ve 1X Dulbecco PBS beş mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın.
Şişeye %0,05 tripsin-EDTA'nın dört mililitresini ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için 37 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp e ve santrifüjü 190 g'da beş dakika aktarın. Supernatant atın ve serum içeren orta bir mililitre peletli hücreleri resuspend.
Daha sonra resuspended hücreleri 100 kat orta ile seyreltin. Plak teşpiçin altı kuyulu bir plakanın her kuyuya seyreltilmiş hücre süspansiyonunun üç mililitresini ekleyin. Hücre bağlayıcı teşp için 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya seyreltilmiş hücre süspansiyonunun bir mililitresini ekleyin.
Plakaları 37 santigrat derecede bir kuluçka makinesinde ve %5 CO2 az doymamış buhara iki veya üç gün kuluçkaya yatırın. Serumsuz ortamda bir mililitre virüs süspansiyonu içeren bir tüpü eksi 80 santigrat derecededepodan 37 santigrat derece su banyosuna aktarın. Domuz pankreasından bir mililitrevirüs süspansiyon ve daha sonra girdap tripsin mikrolitre başına bir mikrogram ekleyin.
Virüs süspansiyonuna 37 santigrat derece ve %5 CO2 az doymamış buharı 30 dakika kuluçkaya yatırın. Enfeksiyon veya MOI'nin çokluğunu hücre başına 0,1 pfu'ya ayarlamak için aktif virüs süspansiyonunu serumsuz ortamla seyreltin. Hücre kaplamaüç gün sonra bir T75 şişesinde MA104 hücrelerine seyreltilmiş virüs süspansiyon bir mililitre ekleyin.
Hücreleri 37 derecede virüsle bir saat boyunca tüplü olarak her 15 dakikada bir hafifçe sallayarak kuluçkaya yatırın. Sonra şişe pankreas tan şişetripsin tripsin mililitre başına dört mikrogram içeren bir serum içermeyen orta 30 mililitre ekleyin. Şişeyi 37 santigrat derece ve %5 CO2 az doymamış buharla kuluçkaya yatırın.
Sıfır, altı, 12, 18, 24 ve 36 saat enfeksiyon sonrası şişede supernatant bir mililitre toplamak ve bir pipet kullanarak 1.5 mililitre türleri supernatant değiştirin. Eksi 80 santigrat derecede 15 dakika içinde donma-çözülme döngüsü ve ardından 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakikalık bir erime gerçekleştirin. Sonra tüpleri 12, 600 g'da 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.
Supernatant toplamak. Hücre fraksiyonunu kaldırmak için distile 0,2 mikron filtre ile supernatant filtre. Virüs titresini ölçmek için plak testine uygulayana kadar süpernatantı eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Plak tayini yapmaya hazır olduğunuzda, toplanan süpernatantiçeren tüpleri 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. 10 kat seyreltilmiş örnek bir mililitre trypsin ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Bu 30 dakikalık kuluçka sırasında, serum içeren ortamı çıkardıktan sonra MA104 hücrelerini altı kuyulu bir tabakta 1X PBS'nin iki mililitresi ile dikkatlice yıkayın.
İnmiş numuneleri serumsuz ortamla seri olarak seyreltin ve seyreltilmiş numunenin bir mililitresini her kuyuya aşıla. Plakayı 37 santigrat derecede 90 dakika kuluçkaya yatırın ve %5 CO2 doymuş buharı, her 15 dakikada bir yavaşça sallayarak. Kuluçkadan sonra, altı kuyulu plakadan inokülçıkarın.
Hazırlanan ortama tripsin mililitrebaşına dört mikrogram ekleyin. Yavaşça ama hemen her iyi agarose jel ile karışık orta üç mililitre ekleyin. Agarose jel fazla 10 dakika oda sıcaklığında katılaşmak için izin verin.
Daha sonra plakayı 37 santigrat derecede iki gün kuluçkaya yatırın ve %5 CO2 az doymuş buhar. Daha sonra, her kuyuya 1X PBS ile seyreltilmiş bir mililitre 0,015% Nötr Kırmızı çözelti ekleyin ve aynı koşullarda kuluçkaya yatırın. Üç saat sonra boyaçıkarın ve bir gün kuluçkaya devam edin.
Ertesi gün, her kuyudaki plak sayısını sayın ve mililitre başına pfu hesaplayın. Plak numaralarını temin etmek için plak tetkikinden önce hücre birleşimini dikkatlice kontrol edin. Hücre bağlayıcı testi için, bir domuz pankreasından bir mililitrevirüs süspansiyonuna tripsin mikrolitresi başına bir mikrogram ekleyin ve sonra girdap.
Hücre başına bir pfu MOI ayarlamak için serum içermeyen orta ile virüs süspansiyon seyreltin. MA104 hücrelerini 24 kuyulu bir tabakta bir mililitre tris-tamponlu tuzlu ile iki kez yıkayın. Şimdi hücreleri 100 mikrolitre seyreltilmiş virüs süspansiyonuyla 24 kuyunun her kuyusu yla aşılamaya devam edin.
Her 15 dakikada bir hafifsal sallayarak 90 dakika boyunca dört santigrat derecede plaka kuluçka. Virüs inoculum çıkarın ve tris-tamponlu tuzlu bir mililitre ile iki kez hücreleri yıkayın. Rotavirüs çift iplikli RNA ayıklamak için, her kuyuya 1X PBS 140 mikrolitre ve 560 mikrolitre RNA ekstraksiyon tamponekleyin.
Tampondaki hücrelerin sisi görülmeden bir pipetle yeterince karıştırın. Çift iplikçikli RNA'yı geri kurtardıktan sonra, üreticinin protokolüne göre, rna'yı dennature'da 5 dakika boyunca 95 derecede bir ısı bloğuna, çift iplikli RNA ekstresi içeren 1,5 mililitrelik tüpler yerleştirin. Sonra hemen buz tüpleri yerleştirin ve iki dakikadan fazla kuluçka.
Ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA sentezin. 16 mikrolitre reaksiyon karışımı içeren bir PCR tüpüne dört mikrolitre denatüre viral RNA çözeltisi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmamak için bir pipetle dikkatlice karıştırın. Tüpler aşağı döndükten sonra, bir termocycler ile ters transkripsiyon gerçekleştirin.
Kantitatif PCR için, rotavirüsün NSP3 genom segmentinin 963-1, 049 bölgesini hedefleyen bir quencher-ekleme probu kullanın. Standart plazmidi PCR dereceli suyla seri olarak seyreltin ve kantitatif PCR için ana karışımı yapmaya devam edin. 96 kuyulu PCR plakanın kuyularına 20 mikrolitre ana karışım ekleyin.
Daha sonra 10 kez borulama ile beş mikrolitre cDNA numunesi veya standart plazmidin beş mikrolitresini karıştırın. Metin protokolündeki koşullara göre nicel PCR gerçekleştirin. Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi MA104 hücre yüzeyine bağlı rotavirüs genomunu hesaplayın.
Burada gösterilen rotavirüs bir büyüme eğrisidir. Değiştirilmiş bir Gompertz modeline en az kare yöntemi uygulanarak, belirli büyüme hızı0,197 ve gecikme süresi 6,61 saat olarak tahmin edilmektedir. İlk titrer için sabit fazda göreceli virüs titresi 3.15'tir.
Test edilen altı rotavirüs klonu arasında, belirli büyüme oranının tahmini değerleri 0,19 ile 0,27 arasında değişmektedir. Model montajındaki kararlılık değerlerinin katsayısı 0,98'den fazla olduğundan, bu tahmini değerler güvenilirdir. Hücre bağlayıcı lık teşbinin sonucu, bağlı viral parçacıkların inokülde bulunanlara oranı olan bağlayıcı verimlilik olarak görüntülenir.
Hücre yüzeylerine bağlanan RV virions hücre bağlayıcı töz için 24 kuyuplaka kullanırken yaklaşık% 1 bağlayıcı verimliliği ile mililitre başına yaklaşık 10.000 kopya vardır. Ekili hücreler fiziksel streslere duyarlı olduğundan, tampon ve agar yavaşça ama hızlı bir şekilde dökmek için dikkat edin. Esasen, virüsler için yeni bir sistem tanıtıldı.
Bu sistemi kullanarak, gerçek hücre bağlama yeteneğini ve belirli büyüme oranını enstrümanlarla değerlendirebiliriz. Protokolümüz, henotibik özelliğin ölçülmesinde avantajlıdır. Yeni ortaya çıkan suşları farklı kontrol ederek, virüsler için yeni aşıları değerlendirmek için yardımcı olabilir.
Virüsler BSL-2 patojenleri olarak belirlenmiştir, bu nedenle bu işlemi gerçekleştirmek için BSL-2 deneysel odalar hazırlamanız gerekir.
