Le proteasi sono uno dei gruppi più studiati di supporti biomolecolari nella ricerca accademica e industriale. Il loro potente ruolo in diversi processi fisiologici e patologici li rende un bersaglio di spicco anche nel campo della scoperta di farmaci. Per quanto riguarda la loro intensa ricerca, c'è una grande e continua domanda per lo sviluppo di piattaforme di test di proteasi ad alta produttività e risparmio di tempo e costi compatibili con lo screening della velocità effettiva.
Qui, vorremmo introdurre un protocollo per l'applicazione di una piattaforma di saggia a fluorescenza compatibile con lo screening ad alta produttività basata sulla separazione utilizzando substrati di proteasi di fusione ricombinante fusi mTurquoise2 e mApple. Inoltre, vorremmo dimostrare un metodo per la rinaturazione in gel dei substrati e dei frammenti di scissione dei campioni di dosaggio dopo aver denaturato anche SDS-PAGE. Tutti gli esperimenti sono condotti sull'esempio della proteasi del virus HIV-1.
L'espressione plasmide porta la sequenza codificante di un tag di affinità hexa histadina e una proteina fusion legante maltosio seguita da un sito di scissione di controllo della proteasi del virus dell'incisione del tabacco, una cassetta di clonazione e una proteina fluorescente C-terminale. Linearizzare l'espressione plasmide mediante endonucleasi di restrizione PacI e NheI. Eseguire la ricottura dei primer oligonucleotidi Escherichia coli ottimizzati in avanti e in retromarcia che codificano per la sequenza di substrato di interesse e fianco da parte di punte coese PacI e NheI.
Eseguire l'inserimento dei primer ricotturati nell'espressione linearizzata plasmide per legatura. Per l'espressione proteica, trasformare le cellule competenti BL21(DE3) dalla miscela di legatura. Le proteine fluorescenti saranno nello stesso frame di lettura aperto con i tag di fusione N-terminale solo dopo una legatura di successo.
Pochi giorni dopo la trasformazione, le colonie contenenti l'espressione plasmide che codifica il sito di scissione inserito di interesse mostreranno fluorescenza visibile con o anche senza utilizzare un transilluminatore blu Dark Reader. Aggiungere 10 microlitri stock di glicerolo delle cellule BL21(DE3) che trasportano l'espressione codifica plasmide per la sequenza del sito di scissione di interesse a cinque millilitri mezzo LB contenente 100 microgrammi per ampicillina millilitro in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Incubare la sospensione a 37 gradi per 15 ore mentre si trema costantemente.
Trasferire cinque millilitri coltura batterica a 50 millilitri mezzo LB fresco contenente 100 microgrammi per millilitro ampicillina. Far crescere le cellule a 37 gradi fino ad un'assorbanza da 0,6 a 0,8 a lunghezze d'onda di 600 nanometri. A questo punto, indurre l'espressione proteica con l'aggiunta di IPTG.
D'ora in poi, incubare la coltura per tre ore a 37 gradi mentre si trema continuamente. Dopo l'incubazione, trasferire 25 millilitri della coltura in tubi di centrifuga puliti da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Scartare il supernatante e conservare il pellet di cellule batteriche a meno 70 gradi per almeno un'ora.
I pellet cellulari contenenti le proteine fluorescenti espresse con successo mostrano chiaramente una fluorescenza con o anche senza utilizzare un transilluminatore blu Dark Reader. Posizionare il pellet di cellule congelate sul ghiaccio e lasciarlo scongelare per 15 minuti. Aggiungere due millilitri tampone dilisi al pellet e sospendere le cellule.
Di seguito, aggiungere l'inibitore della proteasi, liberare la sospensione per lizozima e DNasi, sospendere le cellule e incubare la sospensione sul ghiaccio per 15 minuti. Trasferire due volte una sospensione millilitro in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri e sonicare le sospensioni per tre minuti in round di 10 secondi di sonicazione e cinque secondi di pausa. Centrifugare i tubi a 10.000 g per 20 minuti a temperatura ambiente.
I liscivi cellulari batterici cancellati contenenti il substrato fluorescente di interesse mostrano una fluorescenza visibile con o anche senza utilizzare un transilluminatore blu Dark Reader. La procedura del saggio proteasi sviluppato inizia con la preparazione dei campioni di saggio. In primo luogo, i substrati ricombinanti vengono incubati con le perle magnetiche di affinità e si formano le perle magnetiche attaccate al substrato, abbreviate in SAMB.
I SAMB vengono lavati più volte e infine la soluzione stock SAMB viene preparata con l'aliquota di quali campioni di saggio vengono creati. Le reazioni sono inizializzate dall'aggiunta della soluzione proteasi. Dopo la scissione da parte della proteasi, i frammenti proteolitici vengono rilasciati nel supernatante.
La reazione è terminata dalla separazione delle perline magnetiche dal tampone di reazione che contiene i prodotti di scissione fluorescente e l'enzima. I supernanti vengono applicati ai pozzi di una piastra di microtitoro e la fluorescenza è determinata dalla fluorimetria. Le curve di calibrazione vengono generate utilizzando substrati fluorescenti purificati risolti in ogni tampone di dosaggio.
La concentrazione dei prodotti di scissione fluorescente del terminale C e anche quella del substrato applicato nei campioni di saggio sono determinati in base alla pendenza delle curve di taratura. Posizionare il tubo contenente perline magnetiche di nichel-NPA nuove o riciclate in un concentratore di particelle magnetiche. Le perline possono attaccarsi alla parete e/o al coperchio del tubo di microcentrifugo.
Pertanto, capovolgere il concentratore in ogni direzione per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte. Rimuovere il supernatante e scartarlo. Aggiungere il tampone di lysis da 1,8 millilitri alle perline e rimuovere i tubi chiusi dal concentratore.
Sospendere le perline nel tubo scuotendo e/o capovolgendo il tubo fino a quando le perline non sono completamente omogenee. Riposizionare i tubi nel concentratore e capovolgerli in ogni direzione per assicurarsi che tutte le perline siano raccolte. Aprire il tubo e scartare il supernatante.
Aggiungere il lisato sterile batterio eliminato contenente il substrato di interesse e rimuovere il tubo chiuso dal concentratore. Capovolgere i tubi fino a quando le perline non sono completamente omogenee e ruotare i tubi per rotatore, lentamente, a temperatura ambiente per 30 minuti. I SAMB mostrano fluorescenza visibile con o anche senza utilizzare un transilluminatore blu Dark Reader.
Lavare i SAMB tre volte di 1,8 millilitri 1%Tween 20, tampone di lavaggio e tampone di scissione. Aggiungere il buffer di scollatura ai SAMB lavati per creare una soluzione stock SAMB. Se si utilizzano tubi di microcentrifugo a basso legame a proteine a due millilitri, il volume del tampone di scissione applicato è fino a 1,9 millilitri.
Dopo l'aggiunta del tampone, non scuotere o capovolgere il tubo. Chiudere il tubo e rimuoverlo dal concentratore. Preparare tubi di microcentrifugo a basso legame proteico a due millilitri per i campioni di saggio.
Sospendere la soluzione stock SAMB fino a quando non è completamente omogenea e misurare la quantità di substrato da analizzare nelle reazioni trasferendo immediatamente la soluzione stock SAMB nelle fiale del campione. Si raccomanda che il volume della soluzione stock SAMB da trasferire sia da 25 a 300 microlitri, ma deve essere impostato secondo il singolo progetto sperimentale. Posizionare i tubi campione contenenti le sospensioni SAMB aliquote nel concentratore.
Rimuovere con cura il supernatante dai SAMB e scartarlo. Rimuovere i tubi dal concentratore e aggiungere con cura il tampone di reazione ai SAMB. Il volume del tampone di reazione aggiunto deve essere calcolato in base alla singola progettazione sperimentale, ma si raccomanda di impostare il volume finale della miscela di reazione tra 50 e 150 microlitri se si utilizza tubi da due millilitri.
Chiudere i coperchi dei tubi. Ora, gli esempi sono pronti per essere inizializzati. Aggiungere la soluzione enzimatica ai campioni di reazione.
Mescolare accuratamente le perline spostando delicatamente i tubi e posizionare immediatamente i tubi nel termoshaker già tremante. Nel caso di campioni vuoti di substrato e campioni di controllo del substrato, aggiungere rispettivamente tampone di scissione e tampone di eluizione. Trenta secondi prima della fine dell'incubazione, esegni il campione dal termoshaker e giralo prontamente.
Posizionare il tubo sul concentratore e lasciare riposare il tubo per 15 secondi. La raccolta dei SAMB può essere facilitata spostando leggermente il concentratore avanti e indietro. Aprire il coperchio e trasferire il supernatante con attenzione in una piastra o in un nuovo tubo.
Non toccare le perline concentrate dalla punta della pipetta. Il supernatante raccolto dei campioni di controllo del substrato e i campioni di reazione con un alto grado di scissione possono mostrare fluorescenza visibile con o anche senza utilizzare un transilluminatore blu Dark Reader. Trasferire due volte 30 microlitri dei supernatanti campione separati in una micropiatta nera a mezza area.
Misurare la fluorescenza con fluorimetro utilizzando i filtri appropriati in base alla proteina fluorescente applicata. Per la purificazione dei substrati fluorescenti, preparare la stessa soluzione descritta in precedenza e scartare il supernatante. Aggiungere da 400 a 600 microlitri tampone di eluizione ai SAMB e ruotare lentamente i tubi per rotatore a temperatura ambiente per cinque minuti.
Trasferire l'eluato in nuovi tubi di microcentrifugo a basso legame proteico. Mostra una fluorescenza chiaramente visibile con o senza l'uso di un transilluminatore blu Dark Reader. Dopo la purificazione, lo scambio tampone e la misurazione del contenuto proteico, preparare una duplice diluizione seriale in almeno otto fasi, sia dalle soluzioni di substrato risolte dal tampone di eluizione che dal tampone di scissione, utilizzando rispettivamente tampone di eluizione o scissione per la diluizione.
Trasferire 30 microlitri di ogni punto di diluizione in una micropiatta nera a mezza area. Misurare la fluorescenza per fluorimetro utilizzando le stesse impostazioni applicate nella misurazione dei supernanti campione di saggio. Come esempio per l'elaborazione dei dati, le misurazioni cinetiche dipendenti dal substrato della proteasi HIV-1 sono state eseguite su una forma mTurquoise2-fused del substrato ricombinante che codifica il sito di scissione tra la matrice e le proteine capsid nel precursore naturale delle proteine gapiche.
Tracciare i valori corretti relativi di intensità di fluorescenza rispetto alla concentrazione molare dei substrati purificati, risolvere il buffer di scissione o eluizione ed eseguire la regressione lineare. Calcolare la concentrazione molare dei prodotti di scissione del terminale C nei campioni di reazione utilizzando la pendenza della curva di calibrazione basata su tampone di scissione. Calcolare anche la concentrazione del substrato applicata nei campioni di reazione in base alla concentrazione molare del substrato eluitato nei campioni di controllo del substrato utilizzando la pendenza della curva di calibrazione basata sul buffer di eluizione.
I valori di velocità iniziali sono stati calcolati dalla quantità dei frammenti di scissione del terminale C e quindi tracciati rispetto alla concentrazione del substrato applicata. Anche i parametri cinetici sono stati determinati dall'analisi di regressione non lineare di Michaelis-Menten. Dopo aver eseguito il saggio a base di perline magnetiche nichel-NTA, i supernanti del saggio possono essere analizzati anche dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide.
Tuttavia, oltre all'analisi dei campioni di saggio, è anche possibile analizzare i substrati fluorescenti purificati e / o i frammenti di scissione dopo la digestione in soluzione. Per la digestione in soluzione, aliquote i substrati fluorescenti purificati da digerire sciolti in tampone di scissione in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere la soluzione enzimatica ai campioni. Incubare i campioni secondo la progettazione sperimentale e terminare le reazioni con la procedura di preparazione del campione per PAGE.
Per la preparazione non denaturata del campione, mescolare i campioni da analizzare con un buffer di caricamento del campione non denaturante senza agenti riducenti. Nel caso di preparazione del campione denaturato, mescolare i campioni da analizzare con tampone di carico del campione denaturante ed esporre i campioni al trattamento termico a 95 gradi per 10 minuti. Applicare i campioni non denaturati e denaturati nei pozzi del gel SDS-poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi.
Rimuovere la cassetta gel dal modulo in esecuzione. I campioni non denaturati sono già visibili nel gel anche ad occhio nudo o con il transilluminatore blu Dark Reader. Al fine di rilevare i componenti fluorescenti dei campioni denaturati sul transilluminatore, eseguire la rinaturazione in gel lavando l'SDS dal gel.
Aggiungere 100 millilitri di acqua distillata al gel e risciacquarla almeno per 30 minuti. Visualizza le proteine fluorescenti posizionando il gel non macchiato sul transilluminatore blu Dark Reader. Le proteine di fusione fluorescente ricombinante sono state progettate per essere utilizzate come substrati nei saggi proteolitici.
Dopo la scissione da parte della proteasi nel sito specifico di scissione, viene rilasciato il frammento di scissione fluorescente del terminale C e può essere rilevata la sua fluorescenza. Il loro uso nel saggio a base di perline magnetiche nichel-NTA e il rilevamento fluorescente mediante analisi PAGE sono stati ottimizzati utilizzando la proteasi HIV-1. Tuttavia, la piattaforma di saggi sviluppata può essere adatta anche ad altre proteasi.
Le curve di calibrazione dei substrati purificati risolti in tampone di scissione o eluizione sono illustrate sugli esempi di forma fusa mTurquoise2 e mEYFP del substrato ricombinante che codifica il lato di scissione tra la matrice e le proteine capsidi della proteina anecoica hiv naturale. Il saggio a base di perline magnetiche nichel-NTA è uno strumento utile per esaminare l'effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di reazione e quindi rende anche possibile la determinazione dei parametri cinetici enzimatici come Vmax e Km. Il diagramma A mostra un risultato ottimale ottenuto dopo un'analisi eseguita con successo dell'attività dipendente dal substrato su un substrato fuso con mApple.
Al contrario, il diagramma B presenta un risultato non ottimale in cui l'insufficiente omogeneizzazione della soluzione stock SAMB causa problemi nella configurazione delle corrette concentrazioni del substrato, mentre la terminazione impropria dei campioni di reazione si traduce in errori relativamente elevati. Il saggio fornisce anche uno strumento adatto per eseguire studi di tempo-corso e inibitori pure. Il diagramma A mostra la dipendenza dal tempo della scissione proteolitica della proteasi HIV-1 su un substrato fuso con mEYFP, mentre il diagramma B rappresenta l'effetto inibitorio dell'amprenavir sulla reazione di scissione.
Dai dati ottenuti dallo studio inibitorio, è possibile determinare sia la concentrazione enzimatica attiva che la costante inibitoria. Il saggio può anche essere ottimizzato per studiare la dipendenza dell'attività enzimatica dal pH, in quanto è rappresentato dal diagramma A sull'esempio della proteasi del virus dell'incisione del tabacco. Il diagramma B indica una limitazione del saggio per pH e mostra che il pH neutro o leggermente alcalico è pienamente compatibile con le misurazioni, mentre il pH acido facilita la dissociazione spontanea dei substrati dalla superficie delle perline magnetiche.
La figura attuale mostra i substrati fluorescenti intatti purificati, i frammenti fluorescenti di scissione del terminale C, generati dalla digestione in soluzione dalla proteasi HIV-1. I componenti fluorescenti possono essere rilevati nel gel di poliacrilammide contenente SDS mediante transilluminazione della luce blu subito dopo l'elettroforesi se durante la preparazione del campione sono state applicate condizioni di non denaturazione. Le diverse proteine fluorescenti possono essere differenziate in base al loro colore.
Dopo il saggio magnetico a base di perline, le proteine fluorescenti non denaturate nei supernaganti campione possono essere rilevate nel gel anche dall'illuminazione UV. Al contrario, se durante la preparazione del campione vengono applicate condizioni di denaturazione, le proteine denaturate non possono essere rilevate nel gel immediatamente dopo la PAGINA SDS. Tuttavia, le proteine fluorescenti denaturate possono essere parzialmente renature dalla rimozione dell'SDS dal gel e diventare rilevabili.
Pertanto, la SDS PAGE è seguita dalla procedura di rinaturazione in gel. La capacità di rinaturazione delle proteine fluorescenti rende possibile la loro identificazione non solo in base alla loro fluorescenza, ma anche in base al loro peso molecolare. Qui abbiamo dimostrato il protocollo per l'uso della nostra piattaforma di saggia fluorescente a base di perline magnetiche recentemente sviluppata.
Abbiamo dimostrato l'uso di questo sistema sull'esempio degli studi cinetici enzimatici sulla proteasi hiv-1. Abbiamo usato forme fuse con mTurquoise e mApple del substrato di dosaggio ricombinante, che conteneva la sequenza del sito di scissione della proteasi. Oltre all'analisi fluorimetrica, i campioni di saggio sono stati successivamente analizzati anche da SDS PAGE.
Abbiamo dimostrato che le proteine fluorescenti denaturate possono essere parzialmente renature nel gel dopo SDS PAGE che fornisce sia l'identificazione fluorescente che molecolare basata sul peso del substrato e dei frammenti proteolitici.
