Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Las proteasas son uno de los grupos más investigados de apoyo biomolecular en la investigación académica e industrial. Su poderoso papel en varios procesos fisiológicos y patológicos los convierte en un objetivo prominente en el campo del descubrimiento de fármacos también. En cuanto a su intensa investigación, existe una gran y continua demanda para el desarrollo de plataformas de ensayo de proteasa compatibles con cribado de alto rendimiento y tiempo.

Aquí, nos gustaría introducir un protocolo para la aplicación de una plataforma de ensayo de fluorescencia compatible con cribado de alto rendimiento basada en la separación utilizando sustratos de proteasa de fusión recombinante fusionados con mTurquoise2 y mApple. Además, nos gustaría demostrar un método para la renaturalización en gel de los sustratos y los fragmentos de escote de las muestras de ensayo después de desnaturalización sdS-PAGE también. Todos los experimentos se llevan a cabo sobre el ejemplo de la proteasa del virus VIH-1.

El plásmido de expresión lleva la secuencia de codificación de una etiqueta de afinidad de hexa histadina y una proteína de fusión de unión a maltosa seguida de un sitio de escisión de control de la proteasa del virus de la glucosa al tabaco, un casete de clonación y una proteína fluorescente C-terminal. Linearice la expresión plásmido por PacI y NheI restricción endonucleas. Realizar el recocido de la Escherichia coli codón optimizado hacia adelante y hacia atrás introducciones de oligonucleótidos que codifican para la secuencia de sustrato de interés y flanco por PacI y NheI extremos cohesivos.

Realizar la inserción de las imprimaciones recocidos en el plásmido de expresión linealizada por ligadura. Para la expresión de proteínas, transforme las células competentes BL21(DE3) por la mezcla de ligadura. Las proteínas fluorescentes estarán en el mismo marco de lectura abierto con las etiquetas de fusión N-terminal sólo después de una ligadura exitosa.

Unos días después de la transformación, las colonias que contienen la expresión plásmida que codifica el sitio de escote insertado de interés mostrarán fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul del Lector Oscuro. Añadir 10 microlitros de glicerol en las células BL21(DE3)que llevan la codificación del plásmido de expresión para la secuencia de escisión en el lugar de interés a cinco mililitros LB medio que contiene 100 microgramos por mililitro de ampicilina en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Incubar la suspensión a 37 grados durante 15 horas mientras tiemblan constantemente.

Transfiera cinco mililitros de cultivo bacteriano a 50 mililitros de medio LB fresco que contenga 100 microgramos por mililitro ampicilina. Crecer las células a 37 grados a una absorbancia de 0.6 a 0.8 a 600 longitudes de onda nanómetros. En este punto, inducir la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG.

A partir de entonces, incubar el cultivo durante tres horas a 37 grados mientras se agita continuamente. Después de la incubación, transfiera 25 mililitros del cultivo a tubos limpios de centrífuga de 50 mililitros, y cosecha las células por centrifugación. Deseche el sobrenadante y almacene los gránulos de células bacterianas a menos 70 grados durante al menos una hora.

Los pellets celulares que contienen las proteínas fluorescentes expresadas con éxito muestran claramente una fluorescencia con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Coloque el pellet de celda congelada sobre hielo y déjelo descongelar durante 15 minutos. Agregue dos mililitros de tampón de lysis al pellet y suspenda las células.

A partir de ahora, añadir el inhibidor de la proteasa, liberar la suspensión por lyzozyme y DNase, suspender las células e incubar la suspensión sobre hielo durante 15 minutos. Transfiera dos veces las suspensiones de un mililitro en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y sonica las suspensiones durante tres minutos en rondas de 10 segundos de sonicación y cinco segundos de rotura. Centrifugar los tubos a 10.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Los linsatos de células bacterianas despejadas que contienen el sustrato fluorescente de interés muestran fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul dark Reader. El procedimiento del ensayo de proteasa desarrollado comienza con la preparación de las muestras de ensayo. En primer lugar, los sustratos recombinantes se incuban con las perlas magnéticas de afinidad, y se forman las perlas magnéticas unidas al sustrato, abreviadas como SAMB.

Los SAMB se lavan varias veces, y finalmente la solución de stock SAMB se prepara mediante la alícuota de la que se crean muestras de ensayo. Las reacciones se inicializan mediante la adición de la solución proteasa. Tras el escisión de la proteasa, los fragmentos proteolíticos se liberan en el sobrenadante.

La reacción se termina por la separación de las perlas magnéticas del tampón de reacción que contiene los productos de escote fluorescente y la enzima. Los sobrenadantes se aplican a los pozos de una placa de microtíter y la fluorescencia se determina por fluorimetría. Las curvas de calibración se generan utilizando sustratos fluorescentes purificados resueltos en cada búfer de ensayo.

La concentración de los productos de escisión fluorescente C-terminal y también la del sustrato aplicado en las muestras de ensayo se determinan en función de la pendiente de las curvas de calibración. Coloque el tubo que contiene cuentas de agarosa magnética de níquel-NPA nuevas o recicladas en un concentrador de partículas magnéticas. Las perlas pueden adherirse a la pared y/o a la tapa del tubo de microcentrífuga.

Por lo tanto, gire el concentrador boca abajo en todas las direcciones para asegurarse de que se recogen todas las cuentas. Retire el sobrenadante y deséchelo. Añadir 1.8 mililitros tampón de lysis a las perlas y quitar los tubos cerrados del concentrador.

Suspenda las perlas en el tubo agitando y/o girando el tubo boca abajo hasta que las perlas sean completamente homogéneas. Coloque los tubos de nuevo en el concentrador y gire al revés en todas las direcciones para asegurarse de que se recogen todas las cuentas. Abra el tubo y deseche el sobrenadante.

Añadir el izado de bacterias estériles transparente que contenga el sustrato de interés y retirar el tubo cerrado del concentrador. Gire los tubos boca abajo hasta que las perlas sean completamente homogéneas y gire los tubos por rotador, lentamente, a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los SAMB muestran fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader.

Lave los SAMB tres veces por 1,8 mililitros 1%Tween 20, tampón de lavado y tampón de escote. Agregue el búfer de escote a los SAMB lavados para crear una solución de almacenamiento SAMB. Si utiliza tubos de microcentrífuga de proteína baja-baja de dos mililitros, el volumen del tampón de escote aplicado es de hasta 1,9 mililitros.

Después de la adición del tampón, no agitar ni girar el tubo boca abajo. Cierre el tubo y retírelo del concentrador. Prepare tubos de microcentrífuga de dos mililitros de proteína baja y unión para las muestras de ensayo.

Suspenda la solución de la reserva de SAMB hasta que sea completamente homogénea y mida la cantidad de sustrato a analizar en las reacciones transfiriendo inmediatamente la solución de stock SAMB a los viales de muestra. Se recomienda que el volumen de la solución de material SAMB que se va a transferir sea de 25 a 300 microlitros, pero debe ajustarse de acuerdo con el diseño experimental individual. Coloque los tubos de muestra que contienen las suspensiones SAMB alícuotas en el concentrador.

Retire cuidadosamente el sobrenadante de los SAMB y deséchelo. Retire los tubos del concentrador y agregue cuidadosamente el búfer de reacción a los SAMB. El volumen del búfer de reacción añadido debe calcularse de acuerdo con el diseño experimental individual, pero se recomienda ajustar el volumen final de la mezcla de reacción entre 50 y 150 microlitros si se utilizan tubos de dos mililitros.

Cierre las tapas de los tubos. Ahora, los ejemplos están listos para ser inicializados. Agregue la solución enzimática a las muestras de reacción.

Revuelva las perlas con cuidado moviendo suavemente los tubos y coloque los tubos inmediatamente en el termoejedor que ya está agitando. En el caso de muestras en blanco de sustrato y muestras de control de sustrato, agregue tampón de escote y tampón de elución respectivamente. Treinta segundos antes del final de la incubación, saque la muestra del termocaseador y gítela rápidamente.

Coloque el tubo sobre el concentrador y deje reposar el tubo durante 15 segundos. La recolección de los SAMB puede facilitarse moviendo ligeramente el concentrador hacia adelante y hacia atrás. Abra la tapa y transfiera el sobrenadante cuidadosamente a una placa o a un tubo nuevo.

No toque las perlas concentradas por la punta de la pipeta. El sobrenadante recogido de las muestras de control de sustrato y las muestras de reacción con un alto grado de escote pueden mostrar fluorescencia visible con o incluso sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Transfiera dos veces 30 microlitros de los sobrenadantes de muestra separados a una microplaca negra de media área.

Mida la fluorescencia por fluorómetro utilizando los filtros apropiados de acuerdo con la proteína fluorescente aplicada. Para la purificación de los sustratos fluorescentes, preparar la misma solución como se describió anteriormente, y desechar el sobrenadante. Agregue 400 a 600 microlitros tampón de elución a los SAMB y gire los tubos por rotador lentamente a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Transfiera el eluido a nuevos tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Muestra fluorescencia claramente visible con o sin usar un transilluminador azul Dark Reader. Después de la purificación, el intercambio de tampón y la medición del contenido proteico, preparar una dilución en serie doble en al menos ocho pasos, tanto de las soluciones de sustrato resuelto por elución-buffer-y el escopo-buffer-solved, utilizando la elución o el tampón de escisión para la dilución respectivamente.

Transfiera 30 microlitros de cada punto de dilución a una microplaca negra de media área. Mida la fluorescencia por fluorómetro utilizando los mismos ajustes que se aplicaron en la medición de los sobrenadantes de muestra del ensayo. Como ejemplo para el procesamiento de datos, las mediciones cinéticas dependientes del sustrato de la proteasa VIH-1 se realizaron en una forma fusionada con mTurquoise2 del sustrato recombinante que codifica el sitio de escisión entre la matriz y las proteínas cápoides en el precursor natural de la proteína basculante.

Trazar los valores de intensidad de fluorescencia relativa corregidos contra la concentración molar de los sustratos purificados, resolver el búfer de escisión o elución y realizar la regresión lineal. Calcular la concentración molar de los productos de escisión C-terminal en las muestras de reacción utilizando la pendiente de la curva de calibración basada en el búfer de escisión. Calcule también la concentración de sustrato aplicada en las muestras de reacción en función de la concentración molar del sustrato eluido en las muestras de control de sustrato utilizando la pendiente de la curva de calibración basada en búfer de elución.

Los valores de velocidad iniciales se calcularon a partir de la cantidad de fragmentos de escote C-terminal y luego se trazaron contra la concentración de sustrato aplicada. También los parámetros cinéticos fueron determinados por el análisis de regresión no lineal Michaelis-Menten. Después de realizar el ensayo magnético a base de cuentas de níquel-NTA, los sobrenadantes de ensayo también pueden ser analizados por electroforesis de gel de poliacrilamida.

Sin embargo, además del análisis de las muestras de ensayo, también es posible analizar los sustratos fluorescentes purificados y/o los fragmentos de escote después de la digestión en solución. Para la digestión en solución, alicuere los sustratos fluorescentes purificados a digerir disueltos en tampón de escote en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y agregue la solución enzimática a las muestras. Incubar las muestras de acuerdo con el diseño experimental y terminar las reacciones por el procedimiento de preparación de la muestra para PAGE.

Para la preparación de muestras no desnaturaladas, mezcle las muestras que se analizarán con un búfer de carga de muestras no desnaturalable que no contenga agentes reductores. En el caso de la preparación de muestras desnaturaladas, mezcle las muestras a analizar con el tampón de carga de muestras desnaturalablemente y exponga las muestras al tratamiento térmico a 95 grados durante 10 minutos. Aplicar las muestras no desnaturaladas y desnaturaladas en los pomos del gel SDS-poliacrilamida y realizar electroforesis.

Retire el cassette de gel del módulo en funcionamiento. Las muestras no desnaturalizadas ya son visibles en el gel incluso a simple vista o con el transiluminador azul Dark Reader. Para detectar los componentes fluorescentes de las muestras desnaturalizadas en el transilluminador, realice la renaturalización en gel lavando el SDS del gel.

Añadir 100 mililitros de agua destilada al gel y enjuagar al menos durante 30 minutos. Visualice las proteínas fluorescentes colocando el gel no manchado en el transilluminador azul Dark Reader. Las proteínas de fusión fluorescente recombinante fueron diseñadas para ser utilizadas como sustratos en ensayos proteolíticos.

Tras el escisión por la proteasa en el sitio de escisión específico, se libera el fragmento de escote fluorescente C-terminal y se puede detectar su fluorescencia. Su uso en el ensayo magnético basado en cuentas de níquel-NTA y la detección fluorescente mediante análisis PAGE se han optimizado utilizando la proteasa del VIH-1. Sin embargo, la plataforma de ensayo desarrollada también puede ser adecuada para otras proteasas.

Las curvas de calibración de los sustratos purificados resueltos en escisión o tampón de elución se ilustran en los ejemplos de la forma fusionada con mTurquoise2 y mEYFP del sustrato recombinante que codifica el lado de la escisión entre la matriz y las proteínas cápsidas de la proteína anecoica natural del VIH. El ensayo magnético basado en cuentas níquel-NTA es una herramienta útil para examinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de reacción y, por lo tanto, también hace posible la determinación de los parámetros cinéticos enzimáticos como Vmax y Km. El diagrama A muestra un resultado óptimo obtenido después de un análisis realizado con éxito de la actividad dependiente del sustrato en un sustrato fusionado con mApple.

Por el contrario, el diagrama B presenta un resultado subóptimo en el que la homogeneización insuficiente de la solución de stock SAMB causa problemas en el establecimiento de las concentraciones de sustrato adecuadas, mientras que la terminación incorrecta de las muestras de reacción da lugar a errores relativamente altos. El ensayo también proporciona una herramienta adecuada para realizar estudios inhibitorios y de curso de tiempo. El diagrama A demuestra la dependencia temporal de la escisión proteolítica de la proteasa vih-1 sobre un sustrato fusionado con mEYFP, mientras que el diagrama B representa el efecto inhibitorio de amprenavir en la reacción de escisión.

A partir de los datos obtenidos por el estudio inhibitorio, se pueden determinar tanto la concentración enzimática activa como la constante inhibitoria. El ensayo también se puede optimizar para estudiar la dependencia de la actividad enzimática del pH, ya que se representa mediante el diagrama A sobre el ejemplo de la proteasa del virus del humo del tabaco. El diagrama B indica una limitación del ensayo por pH y muestra que el pH neutro o ligeramente alcalic es totalmente compatible con las mediciones, mientras que el pH ácido facilita la disociación espontánea de los sustratos de la superficie de las perlas magnéticas.

La figura actual muestra los sustratos fluorescentes intactos purificados, los fragmentos fluorescentes de escote C-terminal, generados por la digestión en solución por la proteasa del VIH-1. Los componentes fluorescentes se pueden detectar en el gel de poliacrilamida que contiene SDS mediante transilluminación de luz azul justo después de la electroforesis si se aplicaron condiciones no desnaturalizadoras durante la preparación de la muestra. Las diferentes proteínas fluorescentes se pueden diferenciar en función de su color.

Después del ensayo magnético a base de cuentas, las proteínas fluorescentes no desnaturaladas en los sobrenadantes de muestra también se pueden detectar en el gel mediante la iluminación UV. Por el contrario, si se aplican condiciones de desnaturalizado durante la preparación de la muestra, las proteínas desnaturaladas no se pueden detectar en el gel inmediatamente después de la PÁGINA SDS. Sin embargo, las proteínas fluorescentes desnaturaladas pueden ser parcialmente renaturaladas por la eliminación de la SDS del gel y volverse detectables.

Por lo tanto, sdS PAGE es seguido por el procedimiento de renaturalización en gel. La capacidad de renaturalización de las proteínas fluorescentes hace posible su identificación no sólo en función de su fluorescencia, sino también en función de su peso molecular. Aquí demostramos el protocolo para el uso de nuestra plataforma de ensayo de proteasa fluorescente magnética basada en perlas recientemente desarrollada.

Hemos demostrado el uso de este sistema en el ejemplo de estudios cinéticos enzimáticos sobre la proteasa del VIH-1. Utilizamos formas fusionadas con mTurquoise y mApple del sustrato de ensayo recombinante, que contenía la secuencia de sitio de escisión de la proteasa. Además del análisis fluorimétrico, las muestras de ensayo fueron posteriormente analizadas por SDS PAGE también.

Hemos demostrado que las proteínas fluorescentes desnaturaladas se pueden renaturalcar parcialmente en el gel después de SDS PAGE, que proporciona identificación fluorescente y de peso molecular del sustrato y los fragmentos proteolíticos.