프로테아제는 학술 및 산업 연구에서 생체 분자 지원의 가장 조사 된 그룹 중 하나입니다. 몇몇 생리적이고 병리학적인 프로세스에 있는 그들의 강력한 역할은 그(것)들을 또한 약 발견의 분야에서 눈에 띄는 표적으로 만듭니다. 그들의 집중적인 연구에 관해서는, 시간 및 비용 절감 고처리량 검열 호환 형광 프로테시 플랫폼의 개발에 대한 크고 지속적인 수요가 있다.
여기서, 우리는 mTurquoise2-mApple 융합 재조합 융합 프로테아제 기판을 모두 사용하여 분리 계 고처리량 스크리닝 호환 형광 분석 플랫폼의 적용을 위한 프로토콜을 소개하고 싶습니다. 또한, SDS-PAGE를 폐기한 후 분석 시료의 기판 및 분열 단편의 인겔 레아처링에 대한 방법을 시연하고자 한다. 모든 실험은 HIV-1 바이러스 프로테아제의 예에서 수행됩니다.
발현 플라스미드는 육각형 히스타딘 친화성 태그와 말토스 결합 융합 단백질의 코딩 서열을 전달한 다음 담배 에칭 바이러스 프로테아제, 복제 카세트 및 C-말단 형광 단백질의 제어 분열 부위를 전달한다. PacI 및 NheI 제한 엔도니슬리스를 통해 표현식 플라스미드를 선형화합니다. 앞으로 최적화된 대장균 코돈의 어닐링을 수행하고 PacI 및 NheI 응집력 끝에 의해 관심과 측면의 기판 시퀀스에 대한 코드 올리고뉴클레오티드 프라이머를 역으로 한다.
선형식 플라스미드에 어닐프라이머를 삽입하여 결찰한다. 단백질 발현을 위해, 결찰 혼합물에 의해 BL21(DE3)유능한 세포를 변환한다. 형광 단백질은 성공적인 결찰 후에만 N 단말 융합 태그와 동일한 개방 판독 프레임에 있을 것입니다.
변형 후 며칠 후, 접촉된 분열 부위를 코딩하는 발현 플라스미드를 함유한 콜로니는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터를 사용하지 않고도 눈에 보이는 형광을 표시한다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 5밀리리터 LB 배지에 관심 있는 5밀리리터 LB 배지에 관심 있는 분단 부위 시퀀스를 위해 발현 플라스미드 코딩을 운반하는 BL21(DE3) 세포의 10개의 마이크로리터 글리세롤 스톡을 첨가한다. 서스펜션을 15시간 동안 37도에서 배양하여 끊임없이 흔들어 보시고 있습니다.
밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 5밀리리터 신선한 LB 배지에 5밀리리터 세균 배양을 전달합니다. 600 나노미터 파장에서 세포를 37도에서 0.6 ~0.8로 성장시다. 이 시점에서, IPTG의 첨가에 의한 단백질 발현을 유도한다.
이후 37도에서 3시간 동안 문화를 배양하면서 지속적으로 흔들리고 있습니다. 인큐베이션 후, 배양25밀리리터를 깨끗한 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 상체를 버리고 세균성 세포 펠릿을 영하 70도에서 적어도 한 시간 동안 보관하십시오.
성공적으로 발현된 형광 단백질을 함유한 세포 펠릿은 다크 리더 블루 트랜실루미나이터를 사용하지 않고도 형광을 명확하게 보여준다. 얼어붙은 셀 펠릿을 얼음 위에 놓고 15분 동안 해동합니다. 펠릿에 2밀리리터 리시스 버퍼를 추가하고 세포를 일시 중단합니다.
그 후, 프로테아제 억제제를 추가하고, 리조지메와 DNase에 의한 현탁액을 해제하고, 세포를 일시 중단하고, 15분 동안 얼음에 현탁액을 배양한다. 1밀리리터 서스펜션을 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 10초의 초음파 처리 와 5초 의 휴식으로 3분 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다. 실온에서 20분 동안 10g, 000g의 원심분리기.
어세서의 형광기기류를 함유한 클리어된 세균성 세포 용해는 다크 리더 블루 트랜실루미나이터의 유무에 관계없이 눈에 보이는 형광을 보여준다. 개발 된 프로테아제 분석의 절차는 분석 샘플의 준비로 시작됩니다. 첫째, 재조합 기판은 궁합 자기 구슬과 배양되고, SAMB로 약어된 기판 부착 자성 구슬이 형성된다.
SAMB는 여러 번 세척되고, 마지막으로 SAMB 재고 용액은 분석 샘플이 생성되는 알리쿼팅에 의해 제조됩니다. 반응은 프로테아제용액의 첨가에 의해 초기화된다. 프로테아제에 의한 분열시, 프로테오리스틱 파편은 상체로 방출된다.
반응은 형광 분열 제품 및 효소를 포함하는 반응 버퍼로부터 자기 구슬의 분리에 의해 종료된다. 초월제는 마이크로티터 플레이트의 우물에 적용되고 형광은 형광에 의해 결정된다. 교정 곡선은 각 분석 버퍼에서 해결된 정제형 형광 기판을 사용하여 생성됩니다.
C-말단 형광 분열 제품의 농도와 또한 분석 샘플에 적용된 기판의 농도는 교정 곡선의 경사에 기초하여 결정된다. 새로운 또는 재활용 니켈-NPA 자기 아가로즈 구슬을 포함하는 튜브를 자기 입자 농축기에 놓습니다. 구슬은 마이크로 센심 분리기 튜브의 벽 및 / 또는 뚜껑에 붙어있을 수 있습니다.
따라서 모든 구슬이 수집되는지 확인하기 위해 농축기를 모든 방향으로 거꾸로 설정합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. 구슬에 1.8 밀리리터 리시스 버퍼를 추가하고 농축기에서 닫힌 튜브를 제거합니다.
구슬이 완전히 균일할 때까지 튜브를 흔들거나 거꾸로 돌리거나 튜브의 구슬을 중단합니다. 튜브를 농축기에 다시 놓고 모든 구슬이 수집되는지 확인하기 위해 모든 방향으로 거꾸로 놓습니다. 튜브를 열고 상체를 폐기합니다.
관심기판이 함유된 클리어드 박테리아 멸균 용재를 추가하고 농축기에서 폐쇄된 튜브를 제거합니다. 구슬이 완전히 균일할 때까지 튜브를 거꾸로 돌리고 30 분 동안 실온에서 천천히 회전기에 의해 튜브를 회전시 회전합니다. SAMBs는 다크 리더 블루 트랜일루미나이터의 사용 없이도 눈에 보이는 형광을 보여줍니다.
SAMB를 1.8 밀리리터 1%Tween 20, 세척 버퍼 및 골짜기 버퍼로 세 번 세척합니다. 세척된 SAMB에 골짜기 버퍼를 추가하여 SAMB 스톡 솔루션을 만듭니다. 2밀리리터 단백질-저결합 마이크로센심분리기 튜브를 사용하는 경우, 적용된 골짜기 버퍼의 부피는 최대 1.9 밀리리터이다.
버퍼를 추가한 후 튜브를 흔들거나 거꾸로 돌리지 마십시오. 튜브를 닫고 농축기에서 제거합니다. 분석 샘플을 위해 2 밀리리터 단백질-저결합 미세원심분리기 튜브를 준비합니다.
SAMB 스톡 솔루션을 완전히 균일해질 때까지 중단하고 SAMB 주식 용액을 즉시 샘플 바이알로 전송하여 반응에서 분석할 기판의 양을 측정합니다. 전송할 SAMB 스톡 솔루션의 부피는 25~300마이크로리터로 권장되지만 개별 실험 설계에 따라 설정되어야 한다. 알리인용 SAMB 현탁액을 포함하는 샘플 튜브를 농축기에 배치합니다.
신중하게 SAMBs에서 상체를 제거하고 폐기. 농축기에서 튜브를 제거하고 SAMB에 반응 버퍼를 조심스럽게 추가합니다. 추가된 반응 버퍼의 부피는 개별 실험 설계에 따라 계산되어야 하지만, 2밀리리터 튜브를 사용하는 경우 50~150 마이크로리터 사이의 반응 혼합물의 최종 부피를 설정하는 것이 좋습니다.
튜브의 뚜껑을 닫습니다. 이제 샘플이 초기화될 준비가 되었습니다. 효소 용액을 반응 샘플에 추가합니다.
튜브를 부드럽게 움직여 구슬을 조심스럽게 저어내고 튜브를 이미 흔들리는 열셰이커에 즉시 넣습니다. 기판 빈 샘플 및 기판 제어 샘플의 경우, 각각 골짜기 버퍼 및 용출 버퍼를 추가합니다. 인큐베이션이 끝나기 30초 전에 열셰이커에서 샘플을 꺼내 서즉시 회전합니다.
튜브를 농축기 위에 놓고 튜브가 15초 동안 방치하십시오. SAMBs의 컬렉션은 농축기를 앞뒤로 약간 이동시킴으로써 촉진될 수 있다. 뚜껑을 열고 상체를 조심스럽게 접시 나 새 튜브로 옮기십시오.
파이펫 의 끝에 의해 농축 구슬을 만지지 마십시오. 기판 대조군 샘플및 높은 수준의 분열로 반응 시료의 수집된 상체는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터를 사용하지 않고도 눈에 보이는 형광을 나타낼 수 있다. 분리된 시료 수퍼나티의 2회 30마이크로리터를 검은 반면적 마이크로플레이트로 옮긴다.
적용된 형광 단백질에 따라 적절한 필터를 사용하여 형광계에 의한 형광을 측정한다. 형광 기판의 정제를 위해, 이전에 설명한 것과 동일한 용액을 준비하고, 상판을 폐기한다. 400~600마이크로리터 용출 버퍼를 SAMB에 추가하고 실온에서 회전기로 튜브를 5분간 천천히 회전합니다.
용액을 새로운 단백질 저결합 미세 원심 분리튜브로 전달합니다. 다크 리더 블루 트랜일루미나이터의 유무에 관계없이 명확하게 보이는 형광을 보여줍니다. 정제, 완충 교환 및 단백질 함량의 측정 후, 용출 버퍼-및 골짜기 버퍼-해결 기판 용액으로부터 적어도 8단계로 2배 연속 희석을 준비하여 각각 희석또는 분열 버퍼를 이용하여 한다.
각 희석 점의 마이크로리터 30개를 검은 반면적 마이크로플레이트로 옮긴다. 분석 시 초월제의 측정에 적용된 것과 동일한 설정을 사용하여 형광계에 의한 형광을 측정한다. 데이터 처리를 위한 예로, HIV-1 프로테아제의 기판 의존적 운동 측정은 천연 갭 단백질 전구체에서 매트릭스와 캡시드 단백질 사이의 분열 부위를 코딩하는 재조합 기판의 mTurquoise2-융합 형태로 수행되었다.
정제된 기판의 어금니 농도에 대해 보정된 상대형형광 강도 값을 플롯하고, 분열 또는 용출 버퍼를 해결하고, 선형 회귀를 수행한다. 분열 버퍼 계 교정 곡선의 경사를 이용하여 반응 샘플에서 C 단말 분열 제품의 어금니 농도를 계산한다. 또한 용출 버퍼 계 교정 곡선의 경사를 이용하여 기판 제어 샘플에서 용출기의 용출 된 기판의 어금니 농도를 기반으로 반응 샘플에서 적용 된 기판 농도를 계산합니다.
초기 속도 값은 C-단말 분열 단편의 양으로부터 계산된 다음 적용된 기판 농도에 대해 플롯하였다. 또한 운동 매개 변수는 Michaelis-Menten 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었다. 니켈-NTA 자기 비드 계 분석체를 수행한 후, 분석 수퍼나티는 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의해 분석될 수 있다.
그러나, 분석 시료의 분석 외에도, 용액 소화 후 정제형 형광기및/또는 분열 단편을 분석할 수도 있다. 용액 소화를 위해, 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 분열 완충체에 용해된 소화되는 정제형 형광 기판을 알리옴표하고, 효소 용액을 샘플에 첨가한다. 실험 설계에 따라 샘플을 배양하고 PAGE에 대한 샘플 준비 절차에 의해 반응을 종료합니다.
비자연적 샘플 제제의 경우, 분석할 시료를 감소 에이전트를 포함하지 않는 비덴토 샘플 적재 버퍼와 혼합합니다. 변성 시료 제제의 경우, 시료를 분해시 로딩 버퍼와 분석하여 샘플을 혼합하고 샘플을 95도에서 10분 동안 열처리에 노출시킵니다. SDS 폴리아크라이알라미드 젤의 우물에 비변성 및 변성 샘플을 적용하고 전기 포뇌를 수행합니다.
러닝 모듈에서 젤 카세트를 제거합니다. 비변성 샘플은 육안으로도 또는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터에서도 젤에서 이미 볼 수 있습니다. 트랜스유미나이터상 변성 시료의 형광 성분을 검출하기 위해, 젤로부터 SDS를 세척하여 인겔 레나티션을 수행한다.
100 밀리리터 증류수를 젤에 넣고 적어도 30분 동안 헹구습니다. 다크 리더 블루 트랜실루미에이터에 얼룩이 없는 젤을 배치하여 형광 단백질을 시각화합니다. 재조합 형광 융합 단백질은 프로테오리스틱 분석기의 기판으로 사용되도록 설계되었다.
특정 분열 부위에서 프로테아제에 의한 분열시, C-말단 형광 분열 단편이 방출되고 그 형광이 검출될 수 있다. 니켈-NTA 자기 비드 기반 분석 및 PAGE 분석에 의한 형광 검출에 대한 사용이 HIV-1 프로테아제(HIV-1 protease)를 사용하여 최적화되었습니다. 그러나, 개발된 분석 플랫폼은 다른 프로테아제에도 적합할 수 있다.
골짜기 또는 용출 완충제로 해결된 정제기의 교정 곡선은 천연 HIV 무반향 단백질의 매트릭스와 캡시드 단백질 사이의 분열 면을 코딩하는 재조합 기판의 mTurquoise2-mEYFP-융합 형태의 예를 예시한다. 니켈-NTA 자기 비드 계 분석은 반응 속도에 기판 농도의 효과를 검사하기 위한 유용한 도구이며, 따라서 또한 Vmax 및 Km과 같은 효소 운동 파라미터의 결정을 가능하게 한다. 다이어그램 A는 mApple 융합 기판에서 기판 의존 활성을 성공적으로 수행한 후 얻은 최적의 결과를 보여줍니다.
대조적으로, 다이어그램 B는 SAMB 스톡 솔루션의 불균성 화가 적절한 기판 농도를 설정하는 데 문제를 야기하는 최적 결과를 제시하며 반응 샘플의 부적절한 종료로 인해 상대적으로 높은 오류가 발생합니다. 분석은 또한 시간 과정 및 억제 연구를 수행하기위한 적절한 도구를 제공합니다. 다이어그램 A는 mEYFP-융합 기판에 대한 HIV-1 프로테아제의 프로테오리틱 분열의 시간 의존성을 나타내고, 도면 B는 절단 반응에 대한 암프로나비르의 억제 효과를 나타낸다.
억제 연구에 의해 얻어진 데이터로부터, 활성 효소 농도 와 억제 상수를 모두 결정할 수 있다. 분석은 또한 pH에 효소 활동의 의존성을 연구하도록 최적화될 수 있으며, 담배 에칭 바이러스 프로테아제의 예에 대한 다이어그램 A로 표현되기 때문입니다. 다이어그램 B는 pH에 의한 분석법의 한계를 나타내며 중성 또는 약간 알칼리 pH가 측정과 완전히 호환된다는 것을 보여주며, 산성 pH는 자기 구슬 표면으로부터 기판의 자발적인 해리를 용이하게 한다.
본 수치는 HIV-1 프로테아제에 의한 용액 소화에 의해 생성된 정제된 형광기, 형광 C 단자 분열 단편을 나타낸다. 형광 성분은 시료 제조 중에 비데스팅 조건이 적용된 경우 전기전경 직후 청색광 과균에 의해 SDS 함유 폴리아크라일아미드 겔에서 검출될 수 있다. 다른 형광 단백질은 그들의 색깔에 따라 분화될 수 있습니다.
자기 비드 기반 분석 후, 샘플 수퍼나티제내의 비변성 형광 단백질도 UV 조명에 의해 겔에서 검출될 수 있다. 대조적으로, 시료 제조 중에 변성 된 단백질을 분해하는 조건이 적용되는 경우, SDS PAGE 직후에 젤에서 변성 단백질을 검출할 수 없다. 그러나, 변성 형광 단백질은 젤로부터 SDS를 제거함으로써 부분적으로 재변될 수 있고 검출될 수 있다.
따라서, SDS PAGE는 인겔 레처화 절차뒤에 선행된다. 형광 단백질의 레나톤 능력은 형광에 기초한 뿐만 아니라 분자량에 기초하여 그들의 확인을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 최근에 개발 된 자기 비드 기반 형광 프로테아제 분석 플랫폼의 사용을위한 프로토콜을 시연했습니다.
우리는 HIV-1 protease에 효소 운동 연구의 예에 이 시스템의 사용을 입증했습니다. 우리는 프로테아제의 분열 부위 서열을 포함하는 재조합 분석 기판의 mTurquoise 및 mApple 융합 형태를 사용했습니다. 형광 분석 외에도 분석 샘플도 SDS PAGE에 의해 분석되었습니다.
우리는 변성 형광 단백질이 기판과 프로테오리스틱 단편의 형광 및 분자량 기반 식별을 모두 제공하는 SDS PAGE 후에 젤에서 부분적으로 재성화될 수 있음을 입증했습니다.
