بروتوكولنا مهم لأنه يمكن استخدامه لتحديد التسلسلات الجينومية التي لا يمكن عزلها عن تسلسلات التنقية المشتركة ، والتي قد تكون معروفة جزئيا فقط. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير مكلفة ، وذلك باستخدام برامج مجانية في الغالب التي يمكن تنزيلها وكذلك مرنة. يمكنك تطبيقه على العديد من الأسئلة البيولوجية.
وتشمل التطبيقات المحتملة تحديد أهداف اللقاح البكتيرية وتحديد الفيروسات التي تختلف تتابعاتها اختلافاً شديداً عن الميكروبات المعروفة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام لا يمكن فيه فصل المجهول تجريبيا، طالما أن التسلسل المرجعي دون الهدف الجينومي متاح. هذه التقنية تأخذ بعض التجربة والخطأ، لذلك الصبر مهم.
قد تحتاج إلى مشكلة اطلاق النار على البرامج. يمكنك استخدام برامج مختلفة عن تلك التي نصفها هنا. استخدم أدلة المستخدم قدر الإمكان.
العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب مفيد لأن العمل الحسابي يعتمد على فهم أساسي لكيفية هيكلة برمجة سطر الأوامر. للبدء، استخدم 0.32 تريدوماتيك لإزالة محولات illumina وقواعد ذات جودة منخفضة. استخدم الإصدار 0.9.11 إنشاء قراءات مدمجة عالية الجودة من القراءة المزاوجة الناتجة عن التشذيب باستخدام المعلمات الافتراضية.
ثم استخدم الزواحف الإصدار 1.1 لتصحيح الأخطاء في القراءات التي تم إنتاجها من خلال الكمثرى. وأخيرا استخدام الثالوث الإصدار 2.4.0 في الوضع الافتراضي لتجميع تسلسل تصحيحها. لمكتبات محددة strand، استخدم المعلمة SS_lib_type.
الإخراج هو ملف FASTA التي سيتم وضعها في دليل جديد يسمى trinity_output. جعل قاعدة بيانات BLAST التسلسل المرجعي nucleotide_reference. fasta في سطر الأوامر.
تطابق BLAST الاستعلام تجميعها إلى قاعدة بيانات المرجع. للحصول على ملف إخراج، استخدم BLAST_results. txt لتوليد الإخراج الجدولية المطلوبة لمعالجة الخطوات subsequence مع البرامج النصية بيثون ، واستخدام outfmt 6 لزيادة اصرامة ، واستخدام تسلسل البروتين من الجمعية كما في استعلام انفجار مع نيوكليوتيد ترجم انفجار ، الذي ينفذ ترجمة سداسية الاتجاه من قاعدة البيانات النيوكليوتيد.
للحصول على تسلسلات البروتين للاستعلام، قم بتشغيل TransDecoder. الأمر long0rfs لتحديد أطول فتح إطارات القراءة من تسلسل الاستعلام تجميعها. الآن تشغيل tblastn.
إذا لزم الأمر، تأكد من اختيار الشفرة الوراثية الصحيحة للكائن الذي يجري دراسته باستخدام db_gencode مع خيار التعليمات البرمجية المناسبة. إذا كان مرجع عالي الجودة للبروتين متاحًا، استخدم البروتين البروتين المطابق مع blastp بدلاً من tblastn جعل قاعدة بيانات BLAST من مرجع البروتين. تأكد من حفظ النتيجة كملف لمعالجة المتلقين للمعلومات، واستخدم الإخراج الجدولي لضمان تحليل البرامج النصية Python بشكل صحيح.
الآن، استخدم البرنامج النصي Python الطرح لإزالة أي تسلسلات مطابقة. لتعيين القراءات إلى التجميع، استخدم BWA-MEM الإصدار 0.7.12 أو 2 القوسي لتعيين القراءة الخام التي تم تحميلها على تجميع الاستعلام. أولاً، فهرسة التجميع ثم تعيين القراءة.
سيكون الإخراج تنسيق SAM. تشغيل البرنامج النصي بيثون إزالةاً. py باستخدام ملف SAM كمدخل.
هذا تعريف أسماء تسلسل الاستعلام بدون أي قراءة مطابقة وحفظها إلى ملف نصي جديد. إخراج الخطوة السابقة قائمة من أسماء التسلسلات في ملف txt. استخراج ملف FASTA مع هذه التسلسلات.
سيكون الإخراج ملف fasta. استخدام عبقرية لتحديد تسلسل التمهيدي الأمثل يدويا. تمييز تسلسل المرشح من 21 إلى 28 أزواج قاعدة التمهيدي إلى الأمام، وتجنب أشواط أربعة أو أكثر من أي قاعدة.
محاولة لاستهداف منطقة مع مزيج موحد إلى حد ما من جميع أزواج قاعدة. A G واحد أو C في ثلاثة نهاية رئيس الوزراء مفيد، مما يساعد على ترسيخ التمهيدي. انقر على علامة التبويب إحصائيات على الجانب الأيمن من الشاشة لعرض درجة حرارة الذوبان المقدرة للتسلسل مع تمييز المنطقة المرشحة.
تهدف لذوبان درجة الحرارة بين 55 و 60 درجة مئوية، مع تجنب يكرر، والجري الطويل من G C.اختيار التمهيدي العكسي بنفس الطريقة، وتقع 150 إلى 250 قاعدة أزواج ثلاثة رئيس الوزراء من التمهيدي إلى الأمام. في حين أن أطوال التمهيدي لا تحتاج إلى مطابقة، ينبغي أن تكون درجة حرارة الذوبان المتوقعة أقرب ما يمكن إلى أن التمهيدي إلى الأمام. تأكد من عكس تسلسل من خلال النقر بزر الماوس الأيمن في Genius بينما يتم تمييز تسلسل في خيار القائمة.
أسلوب بديل هو استخدام الدالة تصميم التمهيدي الذي تم العثور عليه في شريط الأدوات العلوي في إطار تسلسل. إدراج المنطقة لتضخيم تحت المنطقة المستهدفة. تحت علامة التبويب الخصائص، إدراج الحجم المطلوب، ودرجة حرارة الذوبان، وفي المائة G C، ثم انقر فوق موافق أن يكون التمهيديات التي تم إنشاؤها.
لإجراء التحقق الكمي PCR من التسلسل المتبقي، أولاً إعداد خليط تفاعل لكل قالب في ثلاثية، مع لدينا SYBR الأخضر ماجستير ميكس، التمهيديات إلى الأمام وعكس، والماء، لحجم إجمالي 25 ميكرولتر. تشغيل برنامج qPCR على علم من درجة الحرارة التي تم التحقق من صحتها سابقا وتمديد الوقت. يجب أن يتم إنشاء منحنيات القذف النهائية على الأقل في المرة الأولى التي يتم فيها استخدام الأقواس التمهيدية في qPCR للتحقق من تضخيم منتج واحد من الحمض النووي.
قياس إشارات QPCR SYBR الخضراء نسبة إلى Actin بواسطة Ct لجميع الحالات، وحساب المتوسط، والانحراف المعياري من اثنين إلى Ct نسبة إلى Actin. تنفيذ نقطة النهاية هلام الكهربائية، لتأكيد الكشف عن حجم المنتج الصحيح من قبل qPCR. هنا، تشغيل 25 ميكروليتر من المنتج qPCR مختلطة مع خمس ميكروليتر من صبغة 6X غليترول على هلام 2٪ TAE Agarose في 200 فولت لمدة 20 دقيقة.
إذا أظهر qPCR الخاص بك أنك لم تحدد تسلسلات الهدف، كرر الدورة بأكملها مع مرجع جديد، والتي يمكن الحصول عليها من قاعدة بيانات عبر الإنترنت. بدأ المشروع الطرحي في هذه الحالة بتسلسل الحمض النووي الريبي من الأنسجة المبزّنة بالجرثومة من الحمار الوحشي البالغ الذكري والإناث. في نهاية المطاف، تم تحديد 935 جينات جسدية لم تكن مدرجة من قبل في شرح الجينوم بأكمله.
بعد التصفية الحسابية، قد تنتج PCR الكمية نتيجة سلبية حيث لم يكن هناك فرق في الكشف عبر أنسجة الطيور. وعلى العكس من ذلك، يتم تأكيد نتيجة إيجابية تمثل تحديد تسلسل الهدف الحقيقي عندما يظهر qPCR الحمض النووي الجينومي كشف أكبر إحصائيا في الأنسجة ذات الاهتمام، نسبة إلى المرجع. هنا، تم التحقق من صحة الجين ألفا المفاجئة لتكون مقيدة على الخط الجرثومي لأنه كان مستنفدا في الأنسجة الجسدية نسبة إلى الحمض النووي الخصية حيث كان حاضرا أن مستويات تعادل أكتين.
من المهم أن نتذكر لاستخدام المدخلات الصحيحة خلال كل من الخطوات الحسابية. قد تضطر إلى الانتقال من خلال الطرح دورة عدة مرات من أجل الحصول على تسلسل الهدف أو تسلسل. يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليل الفيليوجينتيك والهيكلي والوظيفي على الجينات المكتشفة.
هذه الأساليب الإضافية تعطي نظرة ثاقبة في الأدوار التطورية والوظيفية للجينات. حددنا الجين الأول على كروموسوم طائر الأغنية المقيد بالجراثيم، والذي وسع الاهتمام بهذا العنصر الجينومي المفاجئ. وأظهرت أعمال لاحقة كروموسومات مماثلة في العديد من أنواع الطيور المغردة التي تحتوي على العديد من الجينات الإضافية.
