Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

1. 16S الرنا الريباسي جين Amplicon مكتبة التحضير من قبل أسلوب الانصهار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الاشعال (مهاجم، F343-IONA-MIDXX: 5&#39;- CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG الفريق الاستشاري GCA GCA G-3 &#39;؛ عكس، R533-IonP1: 5&#39;- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 &#39;؛ جريئة: محولات محددة ايون سيل، المائل: مفتاح التسلسل لمعايرة كثافة إشارة في بداية المدى التسلسل؛ الخط عادي: الاشعال قالب معين؛ X ... X: 10 BP الباركود، انظر الجدول رقم 1 لبعض متواليات الباركود)، ومزيج الرئيسي 2X HotStartTaq زائد والعينات. تخلط جيدا قبل الاستخدام، باستثناء مزيج الرئيسي الذي ينبغي أن تكون مختلطة بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج PCR (20 ردود الفعل ميكرولتر) مع 0.5 ميكرومتر من التمهيدي العكسي، 0.4 ملغ / مل من مصل بقري Albumine (BSA) و1X HotStartTaq زائد مزيج الماجستير. إضافة 18.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى البريدمنظمة العمل ضد الجوع PCR أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة التمهيدي إلى الأمام (0.5 ميكرولتر في 20 ملم) مع الباركود مختلف لكل من العينات التي سيتم التسلسل معا. إضافة 1 ميكرولتر من العينة (1-10 نانوغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب في جهاز PCR وتشغيل البرنامج التالي: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. 25 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ استطالة النهائية في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يمكن أن تظل المنتجات PCR في 4 درجات CO / N أو المجمدة حتى استخدامها. </li></ol> 2. Amplicon تنقية، الكمي وتجميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد agarose هلام 2٪ باستخدام أكبر أمشاط المتاحة. إضافة 5 ميكرولتر من هلام صبغ 6X تحميل للتفاعل والحمل على هلام، وفصل كل عينة من بئر فارغة. تشغيل هلام في 70 V لمدة 50 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة من هلام وقطع العصابات (حجم المتوقع حوالي 250 BP: 190 المنتج بي بي بي بي زائد 63 محولات والباركود) باستخدام مشرط نظيفة. </li><lط&gt; وزن العصابات رفعه والمضي قدما في استخراج الهلام وتنقية المنتجات PCR (مع مثل Qiaquick جل استخراج عدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كل منتج PCR مع PicoGreen وجعل التخفيفات للحصول على محلول المخزون في 5 × 10 9 جزيئات / ميكرو لتر (حوالي 1 نانوغرام / ميكرولتر). إذا أظهرت بعض العينات أقل التضخيم، وضبط التخفيفات إلى تركيز أقل، مع الأخذ في الاعتبار أن أقل تركيز مناسب لإجراءات لاحقة هو 1.57 × 10 7 الجزيئات / ميكرولتر (26 م). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع 10 ميكرولتر من كل منتج PCR المخفف للحصول على حمام سباحة متساوي المولية من العينات. تعد واحدة تجمع منفصل لكل من المدى تسلسل المخطط لها. يمكن أن تظل المنتجات PCR المجمعة في الثلاجة حتى استخدامها. </li></ol> 3. مستحلب PCR وتسلسلها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مستحلب PCR: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المنتجات PCR المجمعة إلى 26 مساء في حجم التداول 25 ميكرولتر. الكواشف ذوبان الجليد من قالب مجموعة ايون PGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستحلب PCR مزيج (الكواشف المنصوص عليها في عدة) في غطاء PCR وإضافة منتجات PCR تجميع الجسيمات والمجال (المقدمة) على مقاعد البدلاء. تخلط جيدا ويضاف الخليط في خرطوشة فلتر وأعلى بعناية مع زيت مستحلب (المقدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس ببطء خرطوشة فلتر والحمل على مستحلب الآلي جهاز PCR (مثل ايون بلمسة واحدة 2 الصك). اختيار البرنامج المناسب والبدء في الإجراء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مستحلب الآلي أكملت PCR، وإزالة طاف من أنابيب جمع واسترداد الجسيمات المجال في الجزء السفلي من الأنابيب. Resuspend والمجالات في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل (المنصوص عليها في عدة) واتخاذ قسامة 2.0 ميكرولتر لمكتبة الكمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الكمي المكتبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 100 ميكرولتر من SSPE العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 10MM نابو 4، 1MM نا 2 -EDTA) مع 2 ميكرولتر من محول B &#39;فام (5&#39;- FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG AGG GAT-3 &#39;) التحقيق و 2 ميكرولتر من محول A-Cy5 (5&#39;- Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3&#39;) التحقيق. إضافة 52 ميكرولتر من هذا الخليط إلى قسامة 2.0 ميكرولتر اتخذت في الخطوة 3.2 وإضافة 2 ميكرولتر من محلول الغسيل (من عدة قالب) إلى 52 ميكرولتر المتبقية كما فارغة لالكميات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. نقل الخلائط في 1.5 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.0 مل من العازلة تكس (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA، 0.01٪ تريتون X-100، ودرجة الحموضة 8.0)، ومزيج الطرد المركزي في 15،500 x ج لمدة 3 دقائق في RT. إزالة طاف وترك 20 ميكرولتر في كل أنبوب. كرر هذا الإجراء الغسيل مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 180 ميكرولتر من العازلة تكس، resuspend والجسيمات مكعبات ونقل إلى أنابيب 500 ميكرولتر و qubit. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مضان لFAM وCy5 باستخدام جهاز و qubit وحساب نسبة من المجالات الإيجابية باستخدام آلة حاسبة المتاحة على موقع ايون المجتمع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إثراء تبقى من الجسيمات المجال للمجالات الإيجابية (التي تحتوي على الحمض النووي تضخيم) باستخدام نظام تخصيب الآلي (مثل ايون بلمسة واحدة نظام التخصيب). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكواشف الماصة في الآبار الملائمة للقدم الشريط 8 جيدا: حسنا 1: الجسيمات المجال من الخطوة 3.2. حسنا 2: قبل غسلها الخرز MyOne Streptavidin C1 (13 ميكرولتر). حسنا 3 و 4 و 5: حل غسل (المنصوص عليها في عدة القالب). حسنا 6: فارغة. حسنا 7: تذوب قبالة حل (125 ملي هيدروكسيد الصوديوم، 0.1٪ توين 20)؛ حسنا 8: فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت طرف على الذراع وpipetting لأنبوب 0.2 مل لجمع العينات. بدء الصك. في نهاية التخصيب، إضافة 10 ميكرولتر من تحييد الحل (المقدمة). حبات المخصب يمكن أن تظل على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهيئة أداة التسلسل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال الصك التسلسل وإعداد خطة المدى التسلسل، مع تحديد تفاصيل المدى التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيبهلتر من محلول الغسيل # 2 (المنصوص عليها في عدة التسلسل ايون PGM)، والحل غسل # 1 (350 ميكرولتر 100 ملي هيدروكسيد الصوديوم) والحل عازلة لصناعة السيارات في درجة الحموضة (المقدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء إجراءات التهيئة وعند المطالبة بإضافة dATP، dGTP dCTP والنيوكليوتيدات dTTP (المقدمة) في كل منها 50 مل أنابيب. المسمار الأنابيب على الجهاز التسلسل والاستمرار في إجراء التهيئة. عند اكتمال التهيئة، بدء تشغيل الإجراء فورا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات للتسلسل وتحميل رقاقة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المجالات المخصب من الخطوة 3.4 في الجزء السفلي من الأنبوب بواسطة الطرد المركزي في 15،500 x ج لمدة 1.5 دقيقة. إزالة طاف ترك بالضبط 3 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من التمهيدي التسلسل (المنصوص عليها في عدة التسلسل)، مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا ل resuspend الجسيمات. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 ميكرولتر من البلمرة (المقدمة)، تخلط جيدا وincubيأكلون في RT لمدة 5 دقائق. المضي قدما لتحميل خليط انزيم المجال على رقاقة التسلسل في غضون 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الحضانة، تحميل رقاقة التسلسل على المنظم وإجراء فحص الجودة رقاقة. إزالة السائل من رقاقة بواسطة الطرد المركزي وتحميل العينة في الشريحة بواسطة pipeting ببطء مزيج انزيم المجال (7 ميكرولتر) وتجنب إدخال فقاعات في رقاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي رقاقة ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة في microcentrifuge. تغيير اتجاه الشريحة في كل الطرد المركزي وتخلط بواسطة pipetting صعودا وهبوطا بين كل شوط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل رقاقة في الصك وبدء التشغيل. </li></ol></li></ol> تحليل 4. الأساسية تسلسل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال بخادم بيانات التسلسل وتحميل الملف fastq. إنشاء &quot;oligos&quot; ملف المفصول تحتوي على التمهيدي والباركود المعلومات (انظر المثال في الجدول رقم 1). تحميل الملفات المرجعية Greengenes من الفحص السنويحور الموقع ( <a href="http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline">http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق Mothur وإجراء تحليلات: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملف fastq إلى FASTA وملف الجودة باستخدام الأمر التالي: fastq.info (fastq = test.fastq) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عضوية المجموعة من كل تسلسل وتقليم تسلسل باستخدام الأمر التالي: trim.seqs (FASTA = test.fasta، oligos = barcode.txt، qfile = test.qual، qwindowaverage = 20، qwindowsize = 50، minlength = 150، keepforward = T) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختلف الخيارات يمكن تعديلها وفقا لالتشدد المطلوب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصنيف متواليات في التصنيف greengenes باستخدام الأمر التالي: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta، طريقة = وانغ، مجموعة = test.groups، قالب = gg_99_otus.fasta والتصنيف = gg_99_otus.tax، قطع = 50) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sipos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+PCR+biases+in+environmental+microbiology+studies.">Addressing PCR biases in environmental microbiology studies.</a> Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).</li><li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+PCR+amplification+and+sequencing+artifacts+on+16S+rRNA-based+studies.">Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies.</a> PLoS ONE. 6, e27310 (2011).</li><li>Tringe, S. G., Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+renaissance+for+the+pioneering+16S+rRNA+gene.">A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).</li><li>Margulies, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequencing+in+microfabricated+high-density+picolitre+reactors.">Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.</a> Nature. 437, 376-380 (2005).</li><li>Kuczynski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+community+resemblance+methods+differ+in+their+ability+to+detect+biologically+relevant+patterns.">Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns.</a> Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).</li><li>Bondici, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+communities+in+low-permeability,+high+pH+uranium+mine+tailings:+characterization+and+potential+effects.">Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).</li><li>Auffret, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+water+quality+on+the+bacterial+populations+and+off-flavours+in+recirculating+aquaculture+systems.">Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems.</a> FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).</li><li>Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+microbial+community+structure+affects+diesel+biodegradation+in+an+Arctic+soil.">Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).</li><li>Bell, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictable+bacterial+composition+and+hydrocarbon+degradation+in+Arctic+soils+following+diesel+and+nutrient+disturbance.">Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance.</a> ISME J. 7, 1200-1210 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+microbial+communities+in+the+Athabasca+River+and+its+tributaries+in+relation+to+oil+sands+mining+activities.">Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+biofilms+grown+from+Athabasca+watershed+sediments+are+inhibited+by+increasing+bituminous+compounds+concentrations.">Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).</li><li>Yergeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+expression+profiles+in+the+rhizosphere+of+willows+depend+on+soil+contamination.">Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination.</a> ISME J. 8, 344-358 (2013).</li><li>Deagle, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+sequence+proportions+in+a+DNA-based+diet+study+using+Ion+Torrent+amplicon+sequencing:+which+counts+count.">Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count.</a> Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).</li><li>Milani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+fecal+microbiota:+an+optimized+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene-based+analysis+protocol.">Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol.</a> PLoS ONE. 8, e68739 (2013).</li><li>J&#252;nemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+community+shift+in+treated+periodontitis+patients+revealed+by+Ion+Torrent+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing.">Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing.</a> PLoS ONE. 7, e41606 (2012).</li><li>Petrof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stool+substitute+transplant+therapy+for+the+eradication+of+Clostridium+difficile+infection:+'RePOOPulating'+the+gut.">Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut.</a> Microbiome. 1, 3 (2013).</li><li>Whiteley, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+16S+rRNA+Ion+Tag+and+community+metagenome+sequencing+using+the+Ion+Torrent+(PGM)+Platform.">Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).</li><li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms.">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6, 1621-1624 (2012).</li><li>Kozich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+MiSeq+Illumina+sequencing+platform.">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).</li><li>Hamady, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+UniFrac:+facilitating+high-throughput+phylogenetic+analyses+of+microbial+communities+including+analysis+of+pyrosequencing+and+PhyloChip+data.">Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data.</a> ISME J. 4, 17-27 (2010).</li><li>Quince, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removing+noise+from+pyrosequenced+amplicons.">Removing noise from pyrosequenced amplicons.</a> BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).</li><li>Huse, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ironing+out+the+wrinkles+in+the+rare+biosphere+through+improved+OTU+clustering.">Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering.</a> Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).</li><li>Edwards, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+dynamics+of+initial+bacterial+colonization+of+nonconserved+forage+in+the+bovine+rumen.">Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).</li><li>Rastogi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+toolbox+for+the+culture-independent+quantification+of+total+bacterial+abundances+in+plant+environments.">A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments.</a> J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).</li><li>Baker, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers.">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).</li><li>Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+alignment+quality,+distance+calculation+method,+sequence+filtering,+and+region+on+the+analysis+of+16S+rRNA+gene-based+studies.">The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).</li><li>Links, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperonin-60+universal+target+Is+a+barcode+for+bacteria+that+enables+de+novo+assembly+of+metagenomic+sequence+data.">The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data.</a> PLoS ONE. 7, e49755 (2012).</li><li>Vos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+rpoB+and+16S+rRNA+as+markers+in+pyrosequencing+studies+of+bacterial+diversity.">Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity.</a> PLoS ONE. 7, e30600 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> الطريقة المعروضة هنا واضح وصريح وغير مكلفة، ويجب أن تسمح العديد من المختبرات للوصول إلى السلطة من التسلسل ميتاجينومية. على الرغم من أنه يختلف تبعا لمنصة تسلسل المستخدمة، مرة واحدة هي التي شيدت المكتبات مطلوب القليل جدا من التدريب العملي في الوقت المحدد، مع أكثر من عملية يجري المؤتمتة. لمنصة تسلسل المستخدمة هنا (ايون السيل PGM)، يمكن تنفيذ الإجراء الكامل في غضون يومين من العمل. في لحظة الكتابة (سبتمبر) 2013، كانت تكاليف كاشف المتعلقة المثال المفصلة أعلاه كما يلي: PCR التضخيم من 36 عينة: 25 دولارا، تنقية جل وPicoGreen DNA الكميات من 36 عينة: $ 125، مستحلب PCR لعينة واحدة amplicon المجمعة : 150 دولار والكواشف التسلسل: 250 دولار، أي ما مجموعه 550 دولار أو 15 دولارا للعينة أو 0،0015 $ لكل تصفيتها جودة القراءة. هذا السعر لا يشمل العقد أداة الخدمة، وانخفاض قيمة الصك، راتب فني واستخدام مساحة المختبر. خيمة &quot;&gt; واحدة من الخطوات الأكثر أهمية هو أن تجمع جميع المنتجات في نسبة متساوي المولية، من أجل استرداد عدد مماثل من يقرأ لكل من العينات. تم استخدام PicoGreen الكمي هنا، ولكن أساليب أخرى قد تكون مناسبة، وإن كان أقل دقة (على سبيل المثال، القياس الكمي للأشعة فوق البنفسجية، الكمي القائم على هلام)، وحتى عن طريق القيام بما الكمي الأكثر دقة وتجميع، هناك بعض التباين في عدد من يقرأ لكل عينة، وعلى المدى نموذجي مفصل في الجدول 2، ويتراوح من 4،380 إلى 32،750 يقرأ، بمتوسط ​​10،338 يقرأ، وإذا معالجة عدد كبير من العينات (أكثر من 40-50)، عمود واحد تنقية هلام يمكن الاستعاضة عن تنقية هلام في لوحة أو تنقية باستخدام الخرز مع قطع حجم صرامة (مثل حبات AMPure) . حتى الآن، الجيل المقبل من تكنولوجيا التسلسل الأكثر استخداما لهذا الجين 16S الرنا الريباسي هي 454. وايون سيل تكنولوجيا التسلسل المستخدمة في هذا البروتوكول هو المفهوم مشابهة جداإلى 454 وكلا التقنيتين عرضة لنفس النوع من الأخطاء التسلسل. ليس من المستغرب، أنه قد تبين أنه ايون سيل التسلسل أسفرت نتائج التسلسل مشابهة جدا ل454 تسلسل 10. في الآونة الأخيرة، واستكشفت العديد من الباحثين استخدام التكنولوجيا البورشيد لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 18،19. في أي حال، سيكون من السهل على التكيف مع البروتوكول الحالي للالتعاقب الفوق أخرى مثل MiSeq البورشيد أو 454 GS جديد عن طريق تغيير تسلسل الانصهار التمهيدي لتتناسب مع المحولات والباركود اللازمة لهذه التقنيات التسلسل، كما في طريقة وصفها مؤخرا لالبورشيد MiSeq 19. بدلا من ذلك، يمكن للباحثين تتبع الخطوات 1 و 2 من بروتوكول مفصلة هنا وإرسال amplicons المجمعة إلى مركز التسلسل حيث سيتم تنفيذ مستحلب PCR وتسلسلها. الجينات 16S الرنا الريباسي يقرأ وقلص وتصنيفها باستخدام Mothur، ولكن العديد من التحليلات الأخرى لا يمكن أن يؤديها علىamplicons الجين 16S الرنا الريباسي. على سبيل المثال، والتنوع بيتا يمكن تقييمها عن طريق حساب المسافات بين كل زوج Unifrac عينة باستخدام الإجراء المذكورة في <a href="http://unifrac.colorado.edu/">http://unifrac.colorado.edu/</a> 20. ويمكن حساب مؤشرات التنوع ألفا وعدد الوحدات التصنيفية التشغيلية من كل عينة باستخدام أدوات داخل QIIME مثل AmpliconNoise 21 أو باستخدام الإجراء حددها HUSE آخرون 22 والمتاحة داخل Mothur. الاشعال المستخدمة هنا ضخمت مناطق متغيرة 3 و 4 من الجينات 16S الرنا الريباسي، ولكن يمكن أن استهدفت العديد من المناطق الأخرى. في الدراسة الحالية، تم تضخيم الجينات 16S الرنا الريباسي من المواد النباتية وجاء اختيار التمهيدي لتجنب التضخيم من بلاستيدات الخضراء 16S الرنا الريباسي الجينات 23،24. هناك طائفة واسعة من الاشعال الأخرى المتاحة التي تختلف من حيث طول المنتج، والطاقة التصنيفية وفائدة 25،26. ولكن في جميع الحالات 200-400 BP يقرأ من الجينات 16S الرنا الريباسي لا يمكن تصنيفها بشكل موثوق على مستوى الأنواع، والتحليلات تقتصر على جنس والمستويات التصنيفية أعلى. جينات أخرى قد تكون أكثر ملاءمة إذا كانت هناك حاجة المعلومات على مستوى الأنواع، مثل cpn60 وrpoB الجينات 27،28. قطرات جذرية في المستقبل في تكلفة تسلسل وزيادة قوة الأدوات التحليلية قد تجعل من المجدي استبدال 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين بواسطة metagenomics بندقية، ولكن حتى ذلك الحين يبقى 16S الرنا الريباسي تسلسل الجين المعيار الذهبي علم الأحياء الدقيقة البيئي.

التسلسل ميتاجينومية هي تقنية قوية جدا لأنها تستهدف مجمل المعلومات الوراثية الموجودة في عينة بيئية. هناك نكهات مختلفة من التسلسل ميتاجينومية، بما في ذلك التسلسل بندقية والمكتبات واسع إدراج وamplicon التسلسل. Amplicon تسلسل يوفر ميزة كونها غير مكلفة نسبيا وسريعة وقادرة على انتاج يقرأ من منطقة الجينومية واحدة يمكن الانحياز عموما. بالإضافة إلى ذلك، سير العمل لتحليل البيانات amplicon التسلسل وموحدة في الغالب. ولكن بما أنه يقوم على PCR، فإنه لديه كل التحيزات المتعلقة بخصوصية كاملة، تغطية ناقصة ويتحيز التمهيدي 1،2، مما يجعل هذا النهج شبه الكمي في أحسن الأحوال. العديد من المناطق الجينومية يمكن استهداف للالتسلسل amplicon بما في ذلك الجينات الوظيفية، ولكن الخيارات الأكثر شعبية هي استخدام الجينات علامة مثل الجينات 16S الرنا الريباسي لإنشاء ملف تعريف المجتمع. تقليديا، الجينات 16S الرنا الريباسي amplicon sequeوقد أجريت ncing خارج باستخدام تقنيات كثيفة العمالة التي شملت الاستنساخ في E. القولونية، قطف مستعمرة واستخراج بلازميد تليها سانجر تسلسل على البلازميدات معزولة، وبالتالي تحليلها معظم الدراسات أقل من 100 استنساخ لكل عينة. جلبت الجيل المقبل من التسلسل اثنين التقدم رئيسية: الموازاة الهائل من ردود الفعل التسلسل، والأهم من ذلك، فصل النسيلي من القوالب دون الحاجة لادخال شظايا الجينات في مضيف. وهذا تبسيط كبير تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons، الذي هو الآن يعود إلى ميزة الروتينية العديد من الدراسات علم الأحياء الدقيقة البيئي، مما أدى إلى &quot;النهضة&quot; ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين amplicon 3. منذ ظهور روش 454 تسلسل 4 في عام 2005، ظهرت عدة تقنيات الجيل القادم التسلسل الأخرى في السوق (على سبيل المثال، البورشيد، الصلبة، PacBio). في الآونة الأخيرة، وإدخال تسلسل مقعد بين كبارجلبت التمرير إلى مختبرات صغيرة القدرة التسلسل حكرا على مراكز التسلسل كبيرة. هي خمس آلات الفوق المتاحة حاليا: 454 GS جديد، وايون سيل آلة الجينوم الشخصية (PGM)، وبروتون، والبورشيد MiSeq وNextSeq 500. حين أن جميع هذه التعاقب تقدم أقل يقرأ في تشغيل وقواعد أقل لكل دولار من معظم بالدوام الكامل التعاقب النطاق، فهي أكثر مرونة، وسرعة، وانخفاض اقتناء وتشغيل تكاليفها يجعلها في متناول المختبرات الأكاديمية الصغيرة. بشكل خاص مناسبة التعاقب الفوق جيدا لamplicon، الجينوم صغيرة ومنخفضة التعقيد metagenome التسلسل في دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية، لأن هذا النوع من الدراسات عموما لا يحتاج إلى عمق المدقع من التسلسل. على سبيل المثال، فإنه من المتفق عليه عموما أن لل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين يدرس عدد من يقرأ لكل عينة ليست قصوى، و~ 1،000 يقرأ يمكن أن تولد نفس أنماط وعدة ملايين من يقرأ مجموعات البيانات 5. أما وقد قلت ذلك، الفوق المقبل generatio<html> ن التعاقب تزال تولد كميات كبيرة من البيانات تسلسل، مع عائدات القصوى ل~ 35 م ب ب (454 GS جديد)، ~ 2 جنيها استرلينيا (ايون السيل PGM)، ~ 10-15 جنيها استرلينيا (ايون سيل بروتون)، ~ 10 جنيها استرلينيا (البورشيد MiSeq) و~ 100 جنيها استرلينيا (البورشيد التالي تسلسل 500)، والتي هي أكثر من كافية لمعظم دراسات علم الأحياء الدقيقة البيئية. الجيل المقبل من تسلسل amplicons 16S الرنا الريباسي باستخدام التعاقب الفوق تم تطبيقها مؤخرا إلى مجموعة واسعة من البيئات. على سبيل المثال، تم استخدام ايون السيل PGM المجتمع لتحليل مخلفات منجم اليورانيوم الذي كان درجة الحموضة العالية والمنخفضة خاصة نفاذية 6، من إعادة تدوير نظم الاستزراع 7 من التربة الملوثة النفط والغاز في القطب الشمالي 8،9، التعدين رواسب الرمال النفطية المتضررة و الأغشية الحيوية من نهر أثاباسكا 10،11 من الجذور لالصفصاف المزروعة في التربة الملوثة 12، الهيئات الإنسان والحيوان و13-16 من الهضم اللاهوائي 17. jove_content &quot;&gt; وفي هذه المساهمة التفاصيل نحن نهجنا في تسلسل الجينات 16S الرنا الريباسي amplicons في المنزل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم (لايون السيل PGM)، وبعد استخراج الحمض النووي والجينات 16S الرنا الريباسي وتتضخم باستخدام بادئات البكتيرية مستوى المجال التي تحتوي على محولات التسلسل وفريدة من نوعها، متواليات عينة محددة (الباركود)، ويتم تنقية amplicons، كميا والمجمعة في نسبة متساوي المولية. ثم يتم تضخيم هذه العينات المجمعة clonally في مستحلب PCR والتسلسل. ويتم تحليل تسلسل الناتجة باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية المتاحة للجمهور ( على سبيل المثال، Mothur).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:128px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion 314 Chip Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482261</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Sequencing 200 Kit v2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4482006</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Ion PGM Template OT2 200 Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:128px;">4480974</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStarTaq Plus Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>203646</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primers and probes</td>
			<td style="width:145px;">IDT</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qiaquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA 20 mg/ml</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10,711,454,001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

next-generation sequencing of 16s ribosomal rna gene amplicons

أحد الأسئلة الرئيسية في علم البيئة الميكروبية هو &quot;من هناك؟&quot; يمكن الإجابة على هذا السؤال باستخدام أدوات مختلفة، ولكن واحدة من معايير الذهب طويلة الأمد هو تسلسل amplicons 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) الجينات التي تولدها مستوى المجال PCR ردود الفعل من تضخيم الحمض النووي الجيني. تقليديا، تم تنفيذ ذلك عن طريق الاستنساخ وسانجر (الكهربائي الشعرية) تسلسل amplicons PCR. ظهور الجيل التالي من التسلسل وتبسيط بشكل كبير وزيادة عمق التسلسل ل16S الرنا الريباسي تسلسل الجين. إدخال التعاقب الفوق يسمح الآن مختبرات صغيرة لأداء لهم 16S الرنا الريباسي التسلسل في المنزل في غضون أيام. هنا، هو مفصل نهجا ل16S الرنا الريباسي amplicon الجين تسلسل باستخدام الفوق الجيل القادم من المنظم. يتم تضخيم الحمض النووي البيئي أولا بواسطة PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على محولات التسلسل والباركود. ثم تقترن لهم جسيمات كروية عبر مستحلب PCR. الجسيمات هي ليترoaded على رقاقة يمكن التخلص منها ويتم إدخال الشريحة في الجهاز التسلسل وبعد ذلك يتم إجراء التسلسل. يتم استردادها في شكل تسلسل fastq وتصفيتها ويتم استخدام الباركود لإنشاء عضوية عينة من يقرأ. وتصفيتها واهمال يقرأ ثم يتم تحليلها باستخدام الأدوات المتاحة علانية. تحليل المثال حيث يقرأ صنفت مع خوارزمية تقصي التصنيف ضمن حزمة البرامج وتعطى Mothur. الطريقة الموضحة هنا هو بسيطة وغير مكلفة واضحة وينبغي أن تساعد مختبرات صغيرة للاستفادة من الثورة الجينومية الجارية.

بعد تنقية على هلام، مع 25 دورات PCR التضخيم، منتجات التضخيم عادة بتركيز 0،2 حتي 10،0 نانوغرام في 50 ميكرولتر من المياه. و يمكن أن يختلف على نطاق واسع اعتمادا على تركيز الحمض النووي بدءا، ونوع العينة وعدة تنقية المستخدمة. فمن المستحسن أن إبقاء عدد دورات PCR إلى ادنى حد ممكن لتجنب تشكيل الوهم وتقليل التحيز التضخيم، مع الأخذ في الاعتبار أن جميع العينات يجب تضخيم باستخدام نفس العدد من الدورات. لتقليل عدد بولكلونل يقرأ والمجالات الفارغة وزيادة عدد من يقرأ، يجب أن تكون نسبة و qubit بين 0.1 و 0.3 و يجب أن يكون FAM مضان فوق 200. باستخدام رقاقة 314 على ايون السيل PGM، وبلغ متوسط ​​الانتاج حوالي يقرأ 0.3-0.5 M ذات نوعية جيدة بعد تصفية النتائج في Mothur. ويبين الجدول 2 توزيع نموذجي لعدد من يقرأ بعد كل خطوة من الإجراءات لتشغيل تحتوي على 36 البيئى المضاعفةعينات العقلية ضخمت مع الاشعال تستهدف المنطقة V3-4 من 16S وتحليلها باستخدام Mothur. في Mothur، الإجراء trim.seqs تولد &quot;* .trim.fasta&quot; الملف الذي يحتوي على متواليات التي مرت المرشحات جودة و&quot;* .scrap.fasta&quot; الذي يحتوي على متواليات التي لم يمر على مرشحات الجودة جنبا إلى جنب مع السبب الرفض في رأس التسلسل. عند إمداده الباركود في &quot;oligos&quot; الملف، وهذا الأمر أيضا إنشاء ملف &quot;* .groups&quot; الذي يحتوي على عضوية مجموعة كل تسلسل على أساس تسلسل الباركود. الإجراء classify.seqs يولد &quot;.tax.summary&quot; التي يمكن فتحها في Excel. يحتوي هذا الملف على ملخص للانتماء التصنيفية (في خطوط) لكل من العينات (في الأعمدة). يمكن استخدام هذا الملف للتحليلات الإحصائية والمصب لتصور تركيبة المجتمع على المستويات التصنيفية المختلفة. يحتوي على &quot;.taxonomy&quot; ملف للتصنيف مفصلالانتماء لكل التسلسل. يظهر متوسط ​​تكوين المجتمع على مستوى بعائلة / فئة عبر جميع العينات 36 في الشكل رقم 1. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51709/51709fig1highres.jpg" width="500" /> الرقم 1. متوسط ​​تكوين المجتمع على مستوى بعائلة / فئة في جميع العينات. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="248" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> إلى الأمام </td><td style="width:139px;"> TACGGRAGGCAGCAG </td><td style="width:47px;"></td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> CTAAGGTAAC </td><td> Sample01 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> TAAGGAGAAC </td><td> Sample02 </td></tr><tr heighر = &quot;20&quot;&gt; <td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> AAGAGGATTC </td><td> Sample03 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> TACCAAGATC </td><td> Sample04 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> CAGAAGGAAC </td><td> Sample05 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> CTGCAAGTTC </td><td> Sample06 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> TTCGTGATTC </td><td> Sample07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> TTCCGATAAC </td><td> Sample08 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> TGAGCGGAAC </td><td> Sample09 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;"> الباركود </td><td> CTGACCGAAC </td><td> Sample10 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. مثال &quot;oligos&quot; ملف للاستخدام في Mothur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="660" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"></td><td style="width:67px;"> # من يقرأ </td><td style="width:123px;"> ٪ من الخطوة السابقة </td><td style="width:107px;"> متوسط. لكل عينة </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> عدد الآبار </td><td align="center"> 1262519 </td><td> - </td><td align="center"> 35،070 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> الآبار مع الخرز </td><td align="center"> 1114108 </td><td align="center"> 88.20٪ </td><td align="center"> 30،947 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> الخرز مع القوالب </td><td align="center"> 1112746 </td><td align="center"> 99.90٪ </td><td align="center"> 30،910 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> الخرز وحيدة النسيلة </td><td align="center"> 826805 </td><td align="center"> 74.30٪ </td><td align="center"> 22،967 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:363px;"> يقرأ نوعية جيدة (إخراج من المنظم) </td><td align="center"> 782204 </td><td align="center"> 94.60٪ </td><td align="center"> 21،728 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> تمرير Mothur مرشحات (دقيقة. متوسط ​​درجة جودة 20 على نافذة 50bp، دقيقة. طول 150bp) </td><td align="center"> 372168 </td><td align="center"> 47.60٪ </td><td align="center"> 10،338 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> تصنف على مستوى بعائلة في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) </td><td align="center"> 342171 </td><td align="center"> 91.90٪ </td><td align="center"> 9،505 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> تصنف على مستوى الأسرة في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) </td><td align="center"> 316512 </td><td align="center"> 92.50٪ </td><td align="center"> 8،792 </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:363px;"> تصنف على مستوى جنس في GreenGenes (50٪ عتبة الثقة) </td><td align="center"> 289899 </td><td align="center"> 91.60٪ </td><td align="center"> 8،053 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. عدد يقرأ تنتج من تشغيل نموذجي لمدة 36 العينات البيئية المضاعفة على واحد ايون سيل 314 رقاقة.

Watch this Scientific Journal Video about Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons at JoVE.com

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

next-generation-sequencing-of-16s-ribosomal-rna-gene-amplicons

Research

JoVE Journal

Biology

82.9K Views.  National Research Council Canada. Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer. 

Video: Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

استنزاف الحمض النووي الريبي الريباسي لMetagenomic الوتر البعوض RNA-يليها

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

كفاءة نوكليك حمض استخراج و16S الريباسي جين تسلسل للبكتيريا الجماعة توصيف

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

استهدفت RNA تسلسل الفحص لتحديد خصائص التعبير الجيني والجينوم التعديلات

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

بروتوكول المصحوبة بمرشدين لتوصيف الجراثيم البراز بتسلسل الرنا الريباسي-Amplicon 16S

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...