Sem protocolo, é possível investigar o processo dinâmico de diferenciação myoblast e formação de miofibras, em particular o posicionamento nuclear explorando imagens de células vivas. Imagens de células vivas de míobios com núcleos celulares estranhos permitem o estudo da diferenciação myoblast em células vivas e o rastreamento automático dos núcleos. A demonstração visual ajuda a entender como combinar o isolamento celular primário com a análise de imagens e imagens ao vivo.
Demonstrando o procedimento com Frederica Colombo, será Giorga Careccia, doutoranda em nosso laboratório. Comece colhendo os músculos tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, quadríceps e tríceps de ambos os membros traseiros de um rato adulto em uma placa de Petri de PBS no gelo. Use tesouras e pinças estéreis para remover cuidadosamente os tendões e a gordura de cada músculo e transfira os músculos para uma placa de Petri vazia.
Usando uma tesoura curva estéril cortada e pica-se os músculos até que uma massa uniforme seja obtida e transfira as peças musculares para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de digestão às peças musculares para uma incubação de 30 minutos em um banho de água de 37 graus celsius a 250 rotações por minuto. No final da digestão enzimática, pare a reação com 10 mililitros de meio de bloqueio.
E girar a amostra por centrifugação. Coloque o tubo no gelo e transfira o supernatante para um novo tubo de 50 mililitros. Centrifugar o supernante novamente.
E suspenda a pelota em um milímetro de DMEM. Suplementá-lo com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, no gelo. Digerir a pelota reservada em 10 mililitros de meio de digestão fresco como apenas demonstrado e combinar a pelota digerida com a suspensão celular de reserva, no gelo.
Coe as células puxadas através de um filtro de 70 micrômetros, seguido por um filtro de 40 micrômetros. E lave as células em 15 milímetros de DMEM fresco, suplementado com 10% de FBS. No final da centrifugação, suspenda a pelota em três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos à temperatura ambiente.
Parar a lise após cinco minutos com 40 mililitros de PBS e uma centrifugação adicional. Suspenda a pelota em 20 mililitros de DMEM suplementados com 10% de FBS e pré-emplaquem as células em placa de Petri não revestida. Depois de uma hora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono coletar a célula satélite contendo supernasce.
E pré-placa a suspensão da célula mais duas vezes como demonstrado. Após o último revestimento, colete as células satélites por centrifugação e suspenda a pelota em 40 mililitros de meio de proliferação fresca. A divisão das células entre dois colágenos revestidos 150 mililitros placas de Petri com um micrograma por mililitro de doxiciclina por placa para induzir a expressão H2BGFP.
E devolva as células à incubadora de cultura celular por dois ou três dias. Quando os myoblasts atingirem a densidade experimental apropriada, lave as células em cada prato com cinco mililitros de PBS e retire as células do fundo da placa com dois mililitros de Trypsin por prato a 37 graus celsius por cinco minutos. Confirme o desprendimento por microscopia leve e pare a reação com cinco mililitros de DMEM mais 10% de FBS por placa.
Para imagens de células vivas, a placa duas vezes dez a quinta células em cada poço de uma placa de 12 poços revestida com 350 microliters de meio de diferenciação, complementada com matriz de membrana por porão por poço por duas horas. Quando as células aderirem à parte inferior da placa, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono em um estágio de microscópio confocal e use um objetivo 20 vezes seco para obter campos de visão com centenas de células para adquirir imagens de 16 bits com 1024 por 1024 pixels por quadro a cada seis minutos durante 16 horas. Para cada posição adquirida, gere um arquivo de ponto de ponto multi quadro e baixe e extraia o software de ponto zip fornecido em uma pasta selecionada.
Abra o exemplo da pasta de rastreamento de segmentação e clique em fazer o ponto de segmentação M para abrir a janela de comando no Matlab. Alterar os scripts M de ponto de segmentação devido para que a faixa de nome do arquivo variável seja o nome do arquivo tif e da faixa de entrada do caminho é a pasta onde o ponto tif está contido. Clique em executar para executar o script.
O resultado da segmentação será salvo como um tapete de ponto de arquivo, enquanto a segmentação dos núcleos pode ser visualizada na figura de saída. Para gerar as faixas, primeiro clique duplo gerar faixas ponto M na mesma pasta de trabalho. Em seguida, altere o nome do arquivo para apontar o arquivo dot Mat apropriado para os núcleos segmentados.
Clique em Executar para executar o script. O resultado do rastreamento será salvo como outro arquivo de tapete de ponto e as faixas geradas serão plotadas. Para avaliar a qualidade das faixas.
Primeiro clique duas vezes no ponto de rastreamento de verificação M e modifique o nome do arquivo para o nome de ponto tif apropriado. Em seguida, clique na faixa de nome do arquivo para usar o arquivo do tapete de ponto das faixas e clique em executar. Na janela da figura use a barra de rolagem inferior para selecionar o núcleo.
O núcleo selecionado será circulado em vermelho, e a trajetória da célula selecionada pode ser seguida a tempo usando a barra de rolagem superior. Cruzes verdes indicam os núcleos detectados. Proliferação e diferenciação são fortemente prejudicadas em myoblasts cultivados com Hoechst.
Comparado ao myoblast isolado de camundongos H2BGFP e cultivado com doxiciclina ou tipo selvagem, a cadeia pesada de miosina rotulou myoblasts. Imagens de células vivas com myoblasts primários expressando a proteína H2BGFP permitem o rastreamento dos núcleos durante a diferenciação. Imagens mescladas de transmissão nos canais GFP nos pontos de tempo inicial e final do período de diferenciação, permitem a identificação de miotubos e, consequentemente, núcleos que acabam se integrando aos miótubos ou que não se fundem em miostutos.
Após a imagem por microscopia de fluorescência confocal, os núcleos podem ser segmentados como demonstrado e a transformação da bacia hidrográfica pode ser usada para separar objetos próximos. Com essa abordagem, a maioria dos núcleos são identificados na imagem, permitindo que o movimento dos núcleos seja rastreado como demonstrado. Por exemplo, parece que o comprimento total das trajetórias é ligeiramente maior para células manchadas com Hoechst.
Embora a diferença não seja significativa. No entanto, a computação do deslocamento total durante um lapso de tempo revela que o deslocamento total das células manchadas com Hoechst é significativamente menor do que o de células não manchadas. Como previsto, a variação anual total das células não manchadas é significativamente menor em comparação com as células manchadas com Hoechst.
É importante seguir o protocolo exatamente como demonstrado em particular ao combinar as habilidades técnicas das etapas biológicas com o microscópio confocal e as etapas utilizadas pelo software. Para estudar a diferenciação myoblast e o posicionamento nuclear em outro modelo muscular de interesse é possível transferir móblassto isolado com proteína nuclear fluorescente. Essa técnica abriu caminho para explorar a dinâmica celular e nuclear durante a diferenciação muscular e investigar ainda mais os defeitos nesses processos.
Sob várias condições patológicas, como distrofias musculares.
