Ohne Protokoll ist es möglich, den dynamischen Prozess der Myoblastendifferenzierung und Myofiberbildung, insbesondere der nuklearen Positionierung, durch Nutzung der Live-Zell-Bildgebung zu untersuchen. Die Live-Zellbildgebung von Myoblasten mit fremden Zellkernen ermöglicht das Studium der Myoblastendifferenzierung in lebenden Zellen und die automatische Verfolgung der Kerne. Visuelle Demonstration hilft beim Verständnis, wie primäre Zellisolation mit Live-Bildgebung und Bildgebungsanalyse kombiniert werden kann.
Demonstrieren das Verfahren mit Frederica Colombo, wird Giorga Careccia, ein Doktorand in unserem Labor. Beginnen Sie mit der Ernte der Tibialis soleus, Extensor digitorum longus, gastrocnemius, Quadriceps, und Trizeps Muskeln aus beiden Hinterbeinen einer erwachsenen Maus in eine Petrischale von PBS auf Eis. Verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um sorgfältig die Sehnen und Fett aus jedem Muskel zu entfernen und die Muskeln in eine leere Petrischale zu übertragen.
Mit steriler gebogener Schere schneiden und zerkleinern Sie die Muskeln, bis eine gleichmäßige Masse erreicht wird, und übertragen Sie die Muskelstücke in ein 50 Milliliter Rohr. Dann fügen Sie 10 Milliliter Verdauungsmedium zu den Muskelstücken für eine 30-minütige Inkubation in einem 37 Grad Celsius Wasserbad bei 250 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der enzymatischen Verdauung, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter blockierendes Medium.
Und drehen Sie die Probe durch Zentrifugation. Legen Sie die Röhre auf Eis und übertragen Sie den Überstand in eine neue 50-Milliliter-Röhre. Zentrifugieren Sie den Überstand wieder.
Und das Pellet in einem Millimeter DMEM wieder aufhängen. Ergänzen Sie es mit zehn Prozent fetalem Rinderserum, oder FBS, auf Eis. Das reservierte Pellet in 10 Milliliter frischem Verdauungsmedium verdauen, wie gerade gezeigt, und das verdaute Pellet mit der Reservezellsuspension auf Eis kombinieren.
Dehnen Sie die gezogenen Zellen durch einen 70-Mikrometer-Filter, gefolgt von einem 40-Mikrometer-Filter. Und waschen Sie die Zellen in 15 Millimeter frischem DMEM, ergänzt durch 10 Prozent FBS. Am Ende der Zentrifugation das Pellet in drei Millilitern roter Blutzelllysepuffer bei Raumtemperatur wieder aufhängen.
Stoppen der Lyse nach fünf Minuten mit 40 Milliliter PBS und einer zusätzlichen Zentrifugation. Das Pellet in 20 Milliliter DMEM mit 10 Prozent FBS aufhängen und die Zellen in unbeschichteter Petrischale vorforen. Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid sammeln die Satellitenzelle, die Überstand enthält.
Und die Zellsuspension noch zwei Mal vorzuprächen, wie gezeigt. Nach der letzten Beschichtung die Satellitenzellen durch Zentrifugieren sammeln und das Pellet in 40 Milliliter frischem Proliferationsmedium wieder aufhängen. Die teilen die Zellen zwischen zwei Kollagen beschichtet 150 Milliliter Petri-Schalen mit einem Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin pro Schale, um H2BGFP-Expression zu induzieren.
Und kehren Sie die Zellen für zwei oder drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurück. Wenn die Myoblasten die entsprechende experimentelle Dichte erreicht haben, waschen Sie die Zellen in jeder Schale mit fünf MilliliterPBS und lösen Sie die Zellen mit zwei Milliliter Trypsin pro Schale bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang von den Plattenböden. Bestätigen Sie die Ablösung durch Lichtmikroskopie und stoppen Sie die Reaktion mit fünf MilliliterDMEM plus zehn Prozent FBS pro Platte.
Für die Bildgebung von Lebenden Zellen, Platte zwei mal zehn bis fünf Zellen in jeden Brunnen einer 12 WellPlatte mit 350 Mikroliter Differenzierungsmedium beschichtet, ergänzt mit Kellermembran Matrix pro Brunnen für zwei Stunden. Wenn die Zellen an der Unterseite der Platte haften haben, legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid-Inkubator auf einem konfokalen Mikroskop-Stadium und verwenden Sie ein 20-mal trockenes Ziel, um Sichtfelder mit Hunderten von Zellen zu erhalten, um 16-Bit-Bilder mit 1024 x 1024 Pixeln pro Frame alle sechs Minuten für 16 Stunden zu erfassen. Generieren Sie für jede erworbene Position eine Tif-Datei mit mehreren Frames-Punkten und laden Sie die in einem ausgewählten Ordner bereitgestellte Punkt-Zip-Software herunter und extrahieren Sie sie.
Öffnen Sie das Beispiel des Segmentierungsverfolgungsordners, und klicken Sie auf Segmentierungspunkt M, um das Befehlsfenster in Matlab zu öffnen. Ändern Sie die Skripts für die fällige Segmentierung dot M so, dass die Spur des Variablendateinamens der Name der tif-Datei ist und die Pfadeingabespur der Ordner ist, in dem der Punkt tif enthalten ist. Klicken Sie auf Ausführen, um das Skript auszuführen.
Das Ergebnis der Segmentierung wird als Dateipunktmatte gespeichert, während die Segmentierung der Kerne in der Ausgabefigur visualisiert werden kann. Um die Spuren zu generieren, generieren Sie zuerst tracks dot M im selben Arbeitsordner. Ändern Sie als Nächstes den Dateinamen in Dateinamen, der auf die entsprechende Punktmat-Datei für die segmentierten Kerne zeigt.
Klicken Sie auf Ausführen, um das Skript auszuführen. Das Ergebnis der Verfolgung wird als eine weitere Punktmattendatei gespeichert und die generierten Spuren werden geplottet. Um die Qualität der Spuren zu bewerten.
Doppelklicken Sie zuerst auf den Scheckverfolgungspunkt M, und ändern Sie den Dateinamen in den entsprechenden Punkt-tif-Namen. Klicken Sie dann auf Dateinamenspur, um die Punktmattendatei der Spuren zu verwenden, und klicken Sie auf Ausführen. Verwenden Sie im Abbildungsfenster die untere Bildlaufleiste, um den Kern auszuwählen.
Der ausgewählte Kern wird rot eingekreist, und die Flugbahn der ausgewählten Zelle kann mit der oberen Bildlaufleiste rechtzeitig verfolgt werden. Grüne Kreuze zeigen die erkannten Kerne an. Proliferation und Differenzierung sind in Myoblasten, die mit Hoechst kultiviert werden, stark beeinträchtigt.
Im Vergleich zu Myoblast s isoliert von H2BGFP-Mäusen und mit Doxycyclin oder Wildtyp kultiviert, Myosin schwere Kette mit der Bezeichnung Myoblasten. Die Live-Zell-Bildgebung mit primären Myoblasten, die das H2BGFP-Protein exemittieren, ermöglicht die Verfolgung der Kerne während der Differenzierung. Zusammengeführte Bilder der Übertragung in GFP-Kanälen zu den Anfangs- und Endzeitpunkten der Differenzierungsperiode ermöglichen die Identifizierung von Myoröhren und damit Kernen, die sich in Myotubes integrieren oder nicht in Myotubes verschmelzen.
Nach der Bildgebung mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie können die Kerne wie demonstriert segmentiert und Wassereinzugsgebietstransformationen verwendet werden, um objekte in der Nähe zu trennen. Mit diesem Ansatz werden die meisten Kerne im Bild identifiziert, so dass die Kernbewegung wie demonstriert verfolgt werden kann. Beispielsweise scheint die Gesamtlänge der Flugbahnen bei Zellen, die mit Hoechst befleckt sind, etwas höher zu sein.
Obwohl der Unterschied nicht signifikant ist. Die Berechnung der Gesamtverschiebung während eines Zeitraffers zeigt jedoch, dass die Gesamtverschiebung der mit Hoechst befleckten Zellen deutlich kleiner ist als die der ungefärbten Zellen. Wie vorhergesagt ist die jährliche Gesamtvariation für die ungefärbten Zellen deutlich geringer als bei Mit Hoechst gefärbten Zellen.
Es ist wichtig, das Protokoll genau so zu befolgen, wie es insbesondere bei der Kombination der technischen Fähigkeiten aus den biologischen Schritten mit dem konfokalen Mikroskop und den verwendeten Softwareschritten demonstriert wird. Um myoblast Differenzierung und nukleare Positionierung in einem anderen Muskelmodell von Interesse zu studieren ist es möglich, isolierte Myoblast mit fluoreszierendem Kernprotein zu übertragen. Diese Technik ebnete den Weg, um die zelluläre und nukleare Dynamik während der Muskeldifferenzierung zu erforschen und Defekte in diesen Prozessen weiter zu untersuchen.
Unter verschiedenen pathologischen Bedingungen wie Muskeldystrophien.
