Sans protocole, il est possible d’étudier le processus dynamique de différenciation du myoblaste et de formation du myofiber, en particulier le positionnement nucléaire en exploitant l’imagerie cellulaire vivante. L’imagerie cellulaire vivante du myoblaste avec des noyaux cellulaires étrangers permet l’étude de la différenciation du myoblaste dans les cellules vivantes et le suivi automatique des noyaux. La démonstration visuelle aide à comprendre comment combiner l’isolement des cellules primaires avec l’imagerie en direct et l’analyse d’imagerie.
Giorga Careccia, doctorante dans notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec Frederica Colombo. Commencez par récolter les muscles tibialis soleus, extenseur digitorum longus, gastrocnemius, quadriceps et triceps des deux membres postérieurs d’une souris adulte dans une boîte de Pétri de PBS sur glace. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces à épiler pour enlever soigneusement les tendons et la graisse de chaque muscle et transférer les muscles dans une boîte de Pétri vide.
À l’aide de ciseaux incurvés stériles, coupez et hachez les muscles jusqu’à ce qu’une masse uniforme soit obtenue et transférez les morceaux musculaires dans un tube de 50 millilitres. Ajouter ensuite 10 millilitres de milieu de digestion aux morceaux musculaires pour une incubation de 30 minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius à 250 rotations par minute. À la fin de la digestion enzymatique, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de blocage.
Et faites tourner l’échantillon par centrifugation. Placez le tube sur la glace et transférez le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres. Centrifugez à nouveau le surnatant.
Et re-suspendre la pastille dans un millimètre de DMEM. Complétz-le avec dix pour cent de sérum bovin fœtal, ou FBS, sur la glace. Digérer la pastille réservée en 10 millilitres de milieu de digestion frais comme vient de le démontrer et combiner la pastille digérée avec la suspension cellulaire de réserve, sur la glace.
Filtrer les cellules tirées à travers un filtre de 70 micromètres, suivi d’un filtre de 40 micromètres. Et laver les cellules en 15 millimètres de DMEM frais, complété par 10 pour cent FBS. À la fin de la centrifugation, suspendre à nouveau la pastille en trois millilitres de tampon de lyse de globule rouge à température ambiante.
Arrêt de la lyse après cinq minutes avec 40 millilitres de PBS et une centrifugation supplémentaire. Suspendre à nouveau la pastille en 20 millilitres de DMEM complétée par 10 pour cent de FBS et pré-plaquer les cellules dans la boîte de Pétri non encoated. Après une heure à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone recueillir la cellule satellite contenant supernatant.
Et pré-plaque de la suspension cellulaire deux fois de plus comme démontré. Après le dernier placage, recueillir les cellules satellites par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en 40 millilitres de milieu de prolifération frais. La division des cellules entre deux boîtes de Pétri enduites de collagène de 150 millilitres avec un microgramme par millilitre de doxycycline par plat pour induire l’expression H2BGFP.
Et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant deux ou trois jours. Lorsque les myoblastes ont atteint la densité expérimentale appropriée, laver les cellules dans chaque plat avec cinq millilitres de PBS et détacher les cellules du fond de la plaque avec deux millilitres de trypsine par plat à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Confirmez le détachement par microscopie légère et arrêtez la réaction avec cinq millilitres de DMEM plus dix pour cent de FBS par plaque.
Pour l’imagerie cellulaire vivante, plaquez deux fois dix à la cinquième cellule dans chaque puits d’une plaque de puits de 12 recouverte de 350 microlitres de milieu de différenciation, complétée par matrice membranaire du sous-sol par puits pendant deux heures. Lorsque les cellules ont adhéré au fond de la plaque, placez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de cinq pour cent sur un stade de microscope confocal et utilisez un objectif 20 fois sec pour obtenir des champs de vue avec des centaines de cellules pour acquérir 16 images bits avec 1024 par 1024 pixels par image toutes les six minutes pendant 16 heures. Pour chaque position acquise, générer un fichier tif point multi-images et télécharger et extraire le logiciel zip point fourni dans un dossier sélectionné.
Ouvrez l’exemple du dossier de suivi de segmentation et cliquez sur do segmentation dot M pour ouvrir la fenêtre de commande dans Matlab. Modifiez les scripts M point de segmentation dus de sorte que la piste de nom de fichier variable soit le nom du fichier tif et la piste d’entrée de chemin est le dossier où le tif de point est contenu. Cliquez sur exécuter le script.
Le résultat de la segmentation sera enregistré sous forme de tapis à points de fichier, tandis que la segmentation des noyaux peut être visualisée dans la figure de sortie. Pour générer les pistes, premier double clic générer des pistes point M dans le même dossier de travail. Ensuite, changez le nom du fichier pour le point de nom du fichier mat point approprié pour les noyaux segmentés.
Cliquez sur Exécuter pour exécuter le script. Le résultat du suivi sera enregistré sous forme d’un autre fichier de tapis à points et les pistes générées seront tracées. Évaluer la qualité des pistes.
Cliquez d’abord sur le point de suivi de vérification M et modifiez le nom du fichier au nom de tif point approprié. Cliquez ensuite sur la piste de nom du fichier pour utiliser le fichier de tapis à points des pistes et cliquez sur exécuter. Dans la fenêtre de figure, utilisez la barre de défilement inférieure pour sélectionner le noyau.
Le noyau sélectionné sera encerclé en rouge, et la trajectoire de la cellule sélectionnée peut être suivie dans le temps à l’aide de la barre supérieure de défilement. Les croix vertes indiquent les noyaux détectés. La prolifération et la différenciation sont fortement altérées dans les myoblastes cultivés avec Hoechst.
Comparé à myoblast’s isolé des souris de H2BGFP et cultivé avec la doxycycline ou le type sauvage, myosin chaîne lourde étiquetée myoblastes. L’imagerie cellulaire vivante avec des myoblastes primaires exprimant la protéine H2BGFP permet le suivi des noyaux lors de la différenciation. Les images fusionnées de transmission dans les canaux GFP aux points de temps initiaux et finaux de la période de différenciation permettent l’identification des myotubes et, par conséquent, des noyaux qui finissent par s’intégrer dans les myotubes ou qui ne fusionnent pas dans les myotubes.
Après imagerie par microscopie de fluorescence confocale, les noyaux peuvent être segmentés comme démontré et la transformation du bassin versant peut être utilisée pour séparer les objets voisins. Avec cette approche, la plupart des noyaux sont identifiés dans l’image, permettant au mouvement des noyaux d’être suivi comme démontré. Par exemple, il semble que la longueur totale des trajectoires soit légèrement plus élevée pour les cellules tachées de Hoechst.
Bien que la différence n’est pas significative. Cependant, le calcul du déplacement total pendant un laps de temps révèle que le déplacement total des cellules tachées de Hoechst est significativement plus petit que celui des cellules non tachées. Comme prévu, la variation annuelle totale pour les cellules non tachées est significativement plus faible par rapport aux cellules tachées de Hoechst.
Il est important de suivre le protocole exactement comme démontré en particulier lors de la combinaison des compétences techniques à partir des étapes biologiques avec le microscope confocal et le logiciel utilisé étapes. Pour étudier la différenciation du myoblaste et le positionnement nucléaire dans un autre modèle musculaire d’intérêt, il est possible de transférer le myoblaste isolé avec des protéines nucléaires fluorescentes. Cette technique a ouvert la voie à l’exploration de la dynamique cellulaire et nucléaire lors de la différenciation musculaire et à l’étude des défauts de ce processus.
Dans diverses conditions pathologiques telles que les dystrophies musculaires.
