Без протокола можно исследовать динамический процесс дифференциации миобластов и формирования миофиберов, в частности ядерное позиционирование, используя живую клеточную визуализацию. Визуализация живых клеток миобласта с ядрами инородных клеток позволяет изучать дифференциацию миобластов в живых клетках и автоматическое отслеживание ядер. Визуальная демонстрация помогает понять, как сочетать изоляцию первичных клеток с живыми изображениями и анализом изображений.
Демонстрация процедуры с Фредерикой Коломбо, будет Giorga Careccia, аспирант в нашей лаборатории. Начните с сбора tibialis soleus, extensor digitorum longus, gastrocnemius, четырехглавых и трицепс мышц от обеих задних конечностей взрослой мыши в чашку Петри PBS на льду. Используйте стерильные ножницы и пинцет, чтобы тщательно удалить сухожилия и жир из каждой мышцы и перенести мышцы в пустую чашку Петри.
Использование стерильных изогнутых ножниц вырезать и фарш мышц до однородной массы получены и передачи мышц частей в 50 миллилитров трубки. Затем добавьте 10 миллилитров среды пищеварения к мышечным кусочкам в течение 30 минут инкубации в водяной бане 37 градусов по Цельсию при 250 вращениях в минуту. В конце энзиматической пищеварения, остановить реакцию с 10 миллилитров блокирующей среды.
И спина вниз образца центрифугации. Поместите трубку на лед и перенесите супернатант в новую 50-миллилитровую трубку. Центрифуга супернатант снова.
И повторно приостановить гранулы в один миллиметр DMEM. Дополните его десятью процентами сыворотки крупного рогатого скота плода, или FBS, на льду. Переварить зарезервированные гранулы в 10 миллилитров свежего пищеварения среды, как только что продемонстрировали и объединить переваренные гранулы с резервной подвески клеток, на льду.
Процедить вытянутые клетки через 70-метровый фильтр, а затем 40-метровый фильтр. И мыть клетки в 15 миллиметров свежего DMEM, дополненный 10 процентов FBS. В конце центрифугации повторно приостанавливайте гранулы в трех миллилитров буфера лиза красных кровяных телец при комнатной температуре.
Остановка лиза через пять минут с 40 миллилитров PBS и дополнительной центрифугации. Повторно приостановить гранулы в 20 миллилитров DMEM дополняется 10 процентов FBS и предварительно пластины клеток в неокрашенных Петри блюдо. Через час при 37 градусах цельсия и пяти процентах углекислого газа собирают спутниковую ячейку, содержащую супернатант.
И предварительно пластины подвески клетки еще два раза, как попродемонстрировано. После последнего покрытия соберите спутниковые ячейки путем центрифугации и повторно приостановите гранулы в 40 миллилитров свежей среды пролиферации. Разделить клетки между двумя коллагеновым покрытием 150 миллилитров Петри блюда с одним микрограммом на миллилитр доксициклина на блюдо, чтобы вызвать экспрессию H2BGFP.
И вернуть клетки в инкубатор клеточной культуры на два-три дня. Когда миобласты достигли соответствующей экспериментальной плотности, мыть клетки в каждом блюде с пятью миллилитров PBS и отделить клетки от дна пластины с двумя миллилитров трипсина на блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Подтвердите отслоение световой микроскопией и остановите реакцию с помощью пяти миллилитров DMEM плюс десять процентов FBS на тарелку.
Для живой визуализации клеток, пластины два раза десять-пятые клетки в каждом хорошо 12 хорошо пластины покрыты 350 микролитров дифференциации среды, дополненный матрицы мембраны подвала на колодец в течение двух часов. Когда клетки прилипли к нижней части пластины, поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и пять процентов углекислого газа инкубатор на стадии конфокального микроскопа и использовать 20 раз сухой цели для получения полей зрения с сотнями клеток, чтобы приобрести 16 битных изображений с 1024 к 1024 пикселей на кадр каждые шесть минут в течение 16 часов. Для каждой приобретенной позиции создать многокамерный точечный tif файл и загрузить и извлечь программное обеспечение на молнии точки, представленное в выбранной папке.
Откройте пример папки отслеживания сегментации и нажмите do segmentation dot M, чтобы открыть командное окно в Matlab. Измените скрипты точки M должной сегментации так, чтобы трек с переменным именем файла — это название файла tif, а трек ввода пути — папка, в которой содержится точка tif. Нажмите запустить, чтобы запустить сценарий.
Результат сегментации будет сохранен в качестве коврика точки файла, в то время как сегментация ядер может быть визуализирована на рисунке вывода. Для создания треков, первый двойной клик генерировать треки точка M в той же рабочей папке. Затем измените имя файла, чтобы указать имя соответствующей точки Мат файл для сегментированных ядер.
Нажмите Run, чтобы запустить скрипт. Результат отслеживания будет сохранен в качестве другого файла точечного коврика, а генерируемые треки будут построены. Оценить качество треков.
Сначала дважды щелкните точку отслеживания проверки M и измените имя файла на соответствующее имя точка tif. Затем нажмите на трек имени файла, чтобы использовать файл коврика точки треков и нажмите запустить. В окне рисунка используйте нижнюю планку прокрутки для выбора ядра.
Выбранное ядро будет обведено красным цветом, а траектория выбранной ячейки может быть соблюдена во времени с помощью верхней планки прокрутки. Зеленые кресты указывают на обнаруженные ядра. Распространение и дифференциация сильно нарушены в миобластах, культурных с Hoechst.
По сравнению с myoblast изолированы от H2BGFP мышей и культурируются с доксициклина или дикого типа, миозин тяжелой цепи помечены миобласты. Визуализация живых клеток с первичными миобластами, выражаюми белок H2BGFP, позволяет отслеживать ядра во время дифференциации. Слитые изображения передачи в каналах GFP в начальных и конечных точках времени периода дифференциации, позволяют идентифицировать миотуберы и, следовательно, ядра, которые в конечном итоге интегрируются в миотуберы или которые не сливаются в миотуберы.
После визуализации с помощью конфокального микроскопии флуоресценции ядра могут быть сегментированы, как это было продемонстрировано, а преобразование водораздела может быть использовано для разъединения близлежащих объектов. При этом подходе большинство ядер идентифицируются на изображении, что позволяет отслеживать движение ядер, как это попродемонстрировано. Например, кажется, что общая длина траекторий немного выше для клеток, окрашенных Hoechst.
Хотя разница не является значительным. Тем не менее, вычисление полного перемещения во время промежутка времени показывает, что общее перемещение клеток, окрашенных Hoechst значительно меньше, чем у необложных клеток. Как и предсказывалось, общая годовая вариация для необляхих клеток значительно меньше по сравнению с клетками, окрашенными в Hoechst.
Важно следовать протоколу именно так, как это было продемонстрировано, в частности, при объединении технических навыков от биологических шагов с конфокальный микроскоп и программное обеспечение, используемое шаги. Для изучения дифференциации миобластов и ядерного позиционирования в другой интересной мышечной модели можно перенести изолированный миобласт с флуоресцентным ядерным белком. Этот метод проложил путь к изучению клеточной и ядерной динамики во время дифференциации мышц и дальнейшему исследованию дефектов в этих процессах.
При различных патологических состояниях, таких как мышечная дистрофия.
