هذا البروتوكول مهم لتحديد وظيفة جليكوليك والتنفس الميتوكوندريا في المبيضات ألبيكانس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لقياس وظيفة الميتوكوندريا دون الحاجة إلى تنقية الميتوكوندريا من المبيضات ألبيكان. يمكن تحسين هذه الطريقة للتحقيق في آثار التلاعب الجيني أو التضمينات الكيميائية على مسارات الميتوكوندريا والجليكوليك في المبيضات ألبيكان أو غيرها من مسببات الأمراض الفطرية.
هذه التقنية بسيطة نسبيا. أو اعتمادا على الكائن الحي، واستخدامها قد تساعد على تحسين عدد الخلايا وتركيز مثبطات الميتوكوندريا في فحصها. في غطاء تدفق لارينار، قم بحل بولي-د-ليسين في مياه شبكة الأنسجة إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر.
مزيج من الحل جيدا و aliquot إلى 1.5 ملليلتر microcentrifuge أنابيب التأكد من aliquot على الأقل 1.3 ملليلتر لكل أنبوب. إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط إلى كل بئر من لوحة المقايسة، وتغطي الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ساعتين. ثم استلهم الحل.
شطف آبار لوحة المقايسة مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من المياه الصف زراعة الأنسجة العقيمة، وفتح الغطاء والسماح للآبار لتجفيف الهواء. إذا لم يكن استخدام لوحة اليوم الذي يتم إعداده، تخزينها في أربع درجات مئوية لمدة أقصاها من يومين إلى ثلاثة أيام. في اليوم السابق للتجربة، افتح مجموعة فحص التدفق الإضافي وأزل المحتويات.
ضع خرطوشة المستشعر رأسًا على عقب بجوار لوحة الأدوات المساعدة. ملء كل بئر من لوحة فائدة مع ملليلتر واحد من الفرجان ومن ثم وضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى. تأكد من أن أجهزة الاستشعار التي تحتوي على الفلوروفور مغمورة في الكاليبانت.
احتضان خرطوشة الاستشعار في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير بين عشية وضحاها. في اليوم السابق للمكاصير، تلقيح albicans C المعدة في مرق YPD وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية في شاكر في 200 دورة في الدقيقة. في يوم الفحص ، تمييع عدد مناسب من الخلايا في وسط الفحص لتسفر عن تركيز نهائي من 100 ، 000 خلية لكل 100 ميكرولترات.
أضف 100 ميكرولترات من الخلايا المخففة في كل بئر من صفيحة المقايسة باستثناء الآبار A1 و B4 و C3 و D6. إلى هذه الآبار، إضافة 100 ميكرولترات فقط من وسيط مقايسة لتصحيح الخلفية. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير لمدة 60 دقيقة للسماح للخلايا التمسك سطح لوحة. إعداد المركبات لم مقايسة الدالة الميتوكوندريا في تركيز 10X في وسيط فحص المقابلة على النحو المبين في بروتوكول النص.
إضافة 50 ميكرولتردات من الشام في ميناء A، 50 ميكرولترات من أوليغوميسين في ميناء B، 62 ميكرولترات من سيانيد البوتاسيوم في ميناء C، و 68 ميكرولترات من أنتيميسين A في ميناء D.Next، وإعداد المركبات لمقايس الإجهاد جليكوليك في تركيز 10X في وسيلة فحص المقابلة كما هو مبين في بروتوكول النص. إضافة 50 ميكرولتررس من الجلوكوز إلى ميناء A، 55 ميكرولترسيس من Oligomycin في ميناء B، 62 ميكرولترات من 2-DG في ميناء C، و 68 ميكرولترات من أنتيميسين A في ميناء D.Before الفحص، وفتح محلل تدفق إضافية وإعداد قالب فحص باستخدام علامة التبويب المعالج المقايسة. اتبع الإرشادات خطوة بخطوة وملء كافة المعلومات التي تخرج أثناء الإعداد.
إنشاء تخطيط مجموعة وإعداد البروتوكول كما هو موضح في بروتوكول النص. حفظ هذه التخطيطات قبل الفحص. في وقت الفحص، استعادة البروتوكول المحفوظة عن طريق فتح الملف المقابل في خيار الملف المفتوح في علامة التبويب معالج المقايسة.
ثم قم بتحميل مركبات 10X في المنافذ الخاصة بخراطيش الاستشعار المرطبة التي تحتوي على الفرجانت. قم بتحميل خرطوشة المستشعر في علبة الحامل الخاصة بـ Analyzer تدفق إضافي. ابدأ المعايرة بالنقر على زر البدء على الشاشة.
بعد ذلك، أضف بلطف 350 ميكرولترات من الوسيلة المقايسة إلى لوحة الخلية على طول جانب الجدران لتقليل اضطراب الخلية ليصل الحجم النهائي إلى 450 ميكرولترات. استبدال لوحة فائدة تحتوي على calibrant مع لوحة المقايسة ومواصلة الفحص. بمجرد اكتمال الفحص، قم بإزالة خرطوشة الاستشعار واللوحة.
حفظ الملف في المجلد الوجهة المناسبة. في هذه الدراسة، يتم تقييم الوظائف الحيوية الحيوية من albicans C من قبل محلل تدفق إضافية. كما يتم تضمين متحولة تفتقر إلى بروتين الميتوكوندريا mam33 جنبا إلى جنب مع سلالة مكملة لدراسة آثار حذف بروتين الميتوكوندريا على معدل استهلاك الأكسجين ومعدلات التحمض خارج الخلية.
نوع البرية C albicans يظهر معدل استهلاك الأكسجين من 145 picomoles في الدقيقة الواحدة التي هي أيضا ضمن النطاق الأمثل لأي مقايسة تدفق خارج الخلية. معدل استهلاك الأكسجين القاعدي من النوع البري، mam33 متحولة و mam33 سلالات مكملة تظهر أي اختلافات. وبالمثل، لا توجد فروق كبيرة في معدلات التحمض القاعدي خارج الخلية بين السلالات.
ومع ذلك ، عن طريق تثبيط معقدة الرابع مع سيانيد البوتاسيوم ، ونوع البرية و mam33 متحولة ، وسلالات مكملة mam33 تظهر تحولا كبيرا نحو تحلل. ومع ذلك فشلت سلالة متحولة mam33 لإظهار تحول جليكوليك تعويضي مما يشير إلى أن المسار التابع المركب الرابع يضعف في هذه السلالة. في اختبار الإجهاد الغليكوليكي، تجوع الخلايا من الجلوكوز لمدة ساعة واحدة ويتم قياس معدل استهلاك الأكسجين القاعدي ومعدل التحمض خارج الخلية.
عند المجاعة ، تظهر سلالة mam33 المتحولة انخفاضًا ملحوظًا في استهلاك الأكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية مقارنة بالسلالات الأخرى. وهذا يشير إلى ضعف استخدام الجلوكوز لكل من التنفس وتحلل الدم عندما يتم إجبار الخلايا على حالة المجاعة. بعد حقن الجلوكوز، تظهر جميع السلالات تحفيز كل من معدل استهلاك الأكسجين ومعدل التحمض خارج الخلية.
طلاء لوحة المقايسة يسمح لخلايا المبيضات ألبيكانز التمسك لوحة. سوف الالتزام غير لائق من خلايا المبيضات ألبيكانس تؤثر على نتيجة الفحص. بعد تطوير هذه التقنية ، تم استخدامه في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأمراض التي تعالج كيفية عمل الميتوكوندريا أثناء الظروف الفسيولوجية والمرضية.
على سبيل المثال، باستخدام الخلايا المشتقة من المريض والتحكم في هذا الفحص، من الممكن معالجة أسئلة محددة حول كيفية تغيير وظيفة الميتوكوندريا. وينبغي توخي الحذر أثناء إعداد مثبطات الميتوكوندريا مثل سيانيد البوتاسيوم ومضادات السموم A لأن هذه المركبات سامة للغاية.
