このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスにおける解糖機能およびミトコンドリア呼吸を決定する上で重要である。この技術の主な利点は、それがカンジダアルビカンからミトコンドリアを浄化する必要なしにミトコンドリア機能を測定することを可能にすることです.この方法は、カンジダアルビカンスまたは他の真菌病原体におけるミトコンドリアおよび解糖経路に対する遺伝子操作または化学変調剤の影響を調べるように最適化することができる。
この手法は比較的簡単です。または、生物に応じて、その使用は、細胞数およびそれらのアッセイ中のミトコンドリア阻害剤の濃度を最適化するのに役立つ可能性があります。層流フードで、ポリD-リジンを組織グリッド水に溶解し、1ミリリットル当たり50マイクログラムの最終濃度にします。
溶液をよく混ぜて1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブにアリコートし、チューブあたり少なくとも1.3ミリリットルをアリクォートします。アッセイプレートの各ウェルにこの混合物の50マイクロリットルを追加し、蓋をカバーし、1〜2時間室温でインキュベートします。その後、溶液を吸引します。
500マイクロリットルの無菌組織培養グレードの水でアッセイプレートのウェルを一度すすい、蓋を開けて井戸を空気乾燥させます。準備した日にプレートを使用しない場合は、最大2〜3日間摂氏4度で保管してください。実験の前日に、余分なフラックスアッセイキットを開き、内容物を取り除きます。
ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを上下逆さまに置きます。ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルの校正剤を充填し、センサーカートリッジを元に戻します。蛍光体を含むセンサーがキャリバーに沈んでいるか確認してください。
一晩、非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでセンサーカートリッジをインキュベートします。アッセイの前日、YPDスープで調製したCアルビカンを接種し、200rpmのシェーカーで摂氏30度で一晩成長させる。アッセイの日に、アッセイ培地中の適切な数の細胞を希釈し、100マイクロリットル当たり100,000個の細胞の最終濃度を得る。
希釈した細胞の100マイクロリットルを、ウェルA1、B4、C3、およびD6を除くアッセイプレートの各ウェルに加えます。これらの井戸には、バックグラウンド補正用のアッセイ媒体を100マイクロリットルだけ添加します。非二酸化炭素インキュベーターで37°Cでプレートを60分間インキュベートし、細胞をプレート表面に付着させます。テキストプロトコルに概説されているように、対応するアッセイ媒体中の10倍濃度でミトコンドリア関数アッセイ用の化合物を調製する。
ポートAに50マイクロリットルのSHAM、ポートBにオリゴマイシンの50マイクロリットル、ポートCにシアン化カリウム62マイクロリットル、およびアンティマイシンAの68マイクロリットルをポートD.Nextに加え、テキストプロトコルで概説されているように、対応するアッセイ培地で10X濃度で解糖分解性ストレスアッセイの化合物を調製します。ポートAに50マイクロリットルのグルコース、ポートBにオリゴマイシンの55マイクロリットル、ポートCに2-DGの62マイクロリットル、および68マイクロリットルのAntimycin AをポートD.アッセイの前に、追加のフラックス分析装置を開き、アッセイウィザードタブを使用してアッセイテンプレートを設定します。手順に従って、セットアップ中にポップアウトしたすべての情報を入力します。
グループレイアウトを生成し、テキストプロトコルで概説されているようにプロトコルを設定します。アッセイの前にこれらのレイアウトを保存します。アッセイ時に、アッセイウィザードタブのオープンファイルオプションで対応するファイルを開いて、保存されたプロトコルを復元します。
次に、10X化合物を、キャリブラントを含む水和センサーカートリッジのそれぞれのポートに積み込みます。センサーカートリッジを追加フラックスアナライザのキャリアトレイに取り付けます。画面の開始ボタンをクリックして、調整を開始します。
次に、壁の側面に沿ってセルプレートにアッセイ媒体の350マイクロリットルを静かに加え、最終的な体積を450マイクロリットルにする細胞の乱れを最小限に抑えます。キャリブラントを含むユーティリティプレートをアッセイプレートに交換し、アッセイを続けます。アッセイが完了したら、センサーカートリッジとプレートを取り外します。
ファイルを適切な保存先フォルダに保存します。本研究では、Cアルビカンの生体エネルギー機能を、余計なフラックス分析装置によって評価する。ミトコンドリアタンパク質mam33を欠く変異体も、その補体株と共に含まれており、ミトコンドリアタンパク質の欠失が酸素消費率および細胞外酸性化速度に及ぼす影響を研究する。
Cアルビカンス野生型は、細胞外フラックスアッセイに最適な範囲内にある1分間あたり145ピコモールの酸素消費率を示しています。野生型の基底酸素消費率は、mam33変異体およびmam33相補菌株は違いを示さない。同様に、株間の基底細胞外酸性化率には有意な差は見られない。
しかしながら、シアン化カリウムを用いた複合体-IVを阻害することにより、野生型およびmam33変異体を、mam33相補菌株は、解糖に向かって有意なシフトを示す。mam33変異株は、しかし、化合物-IV依存経路がこの株で損なわれることを示唆する代償解糖シフトを示すことができなかった。解糖解析試験では、細胞は1時間のグルコースを使い果たし、基底酸素消費率と細胞外酸性化率を測定します。
飢餓時に、mam33変異株は、他の株と比較して酸素消費量および細胞外酸性化率を有意に低く示す。これは、細胞が飢餓状態に強制されるとき、呼吸と解糖の両方のためのグルコースの利用障害を示唆しています。グルコースを注入した後、すべての株は、それらの酸素消費率と細胞外酸性化率の両方の刺激を示す。
アッセイプレートのコーティングにより、カンディダ・アルビカンス細胞がプレートに付着します。カンディダ・アルビカンス細胞の不適切な付着は、アッセイ結果に影響を与える。この技術の開発後、生理学的および病理学的状態の間にミトコンドリアがどのように機能するかを扱う幅広い細胞型および疾患に採用されている。
例えば、このアッセイにおいて患者由来および対照細胞を採用し、ミトコンドリア機能がどのように変化するのかの具体的な問題に対処することができる。これらの化合物は非常に有毒であるため、シアン化カリウムや抗ミシンAなどのミトコンドリア阻害剤を調製しながら注意する必要があります。
