이 프로토콜은 칸디다 알비칸스의 글리코리악 기능 및 미토콘드리아 호흡을 결정하기 위해 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 칸디다 알비칸에서 미토콘드리아를 정화할 필요 없이 미토콘드리아 기능을 측정할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 칸디다 알비칸스 또는 기타 곰팡이 병원균의 미토콘드리아 및 글리코리컬 경로에 대한 유전 조작 또는 화학 변조기의 영향을 조사하기 위해 최적화 될 수 있습니다.
이 기술은 비교적 간단합니다. 또는 유기체에 따라, 그들의 사용은 세포 수 와 그들의 분석에서 미토콘드리아 억제제의 농도를 최적화 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 라미나르 플로우 후드에서 티슈 그리드 워터에 폴리-D-리신을 용해하여 밀리리터당 50마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다.
용액을 잘 섞고 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브에 알리쿼트하여 튜브 당 적어도 1.3 밀리리터를 알리쿼트하십시오. 이 혼합물의 50 마이크로리터를 분석 판의 각 웰에 넣고 뚜껑을 덮고 실온에서 1~2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 솔루션을 흡인합니다.
멸균 조직 배양 등급의 물 500 마이크로 리터와 한 번 분석 플레이트의 우물을 헹구고 뚜껑을 열고 우물이 공기 건조할 수 있도록 합니다. 준비된 날에 접시를 사용하지 않을 경우 최대 2~3일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. 실험 전날, 여분의 플럭스 분석 키트를 열고 내용을 제거합니다.
센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다. 유틸리티 플레이트의 각 웰을 1밀리리터의 교정으로 채운 다음 센서 카트리지를 다시 배치합니다. 형광이 포함된 센서가 교정판에 침수되어 있는지 확인합니다.
밤새 이산화탄소 가 아닌 인큐베이터에서 센서 카트리지를 섭씨 37도에서 배양합니다. 분석 전날, YPD 국물에 준비 된 C 알비칸을 접종하고 200 rpm에서 셰이커에서 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 분석 당일, 분석 배지에 적절한 수의 세포를 희석하여 100 마이크로리터 당 100, 000 세포의 최종 농도를 산출한다.
우물 A1, B4, C3 및 D6을 제외한 분석 플레이트의 각 웰에 희석 된 세포의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 이러한 우물에 배경 보정을 위해 분석 매체의 마이크로리터 100개만 추가합니다. 비 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 60분 간 배양하여 세포가 플레이트 표면에 부착하도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 해당 분석 매체에서 10배 농도에서 미토콘드리아 기능 분석에 대한 화합물을 준비한다.
포트 A에 SHAM 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 50 마이크로리터, 항C에 시안화 칼륨 62 마이크로리터, 항마이신 A의 68 마이크로리터를 포트 D.Next에 추가하여, 해당 의정서에 명시된 바와 같이 10배 농도의 글리코리스틱 응력 분석체에 대한 화합물을 준비한다. 항만 B에 50 마이크로리터, 포트 B에 올리고마이신 55마이크로리터, 항만 C에 2-DG의 62 마이크로리터, 항제 A의 68 마이크로리터를 포트 D.assay 전에 추가 플럭스 분석기를 열고 분석 마법사 태브를 사용하여 분석 템플릿을 설정합니다. 단계별 지침을 따르고 설정 중에 나오는 모든 정보를 작성합니다.
그룹 레이아웃을 생성하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로토콜을 설정합니다. 분석 전에 이러한 레이아웃을 저장합니다. 분석 시 분석 마법사 탭에서 열린 파일 옵션에서 해당 파일을 열어 저장된 프로토콜을 복원합니다.
그런 다음 교정판을 포함하는 수화 센서 카트리지의 각 포트에 10X 화합물을 로드합니다. 센서 카트리지를 추가 플럭스 분석기의 캐리어 트레이에 로드합니다. 화면의 시작 버튼을 클릭하여 교정을 시작합니다.
다음으로, 350마이크로리터를 벽면에 세포판에 부드럽게 추가하여 450마이크로리터에 최종 부피를 가져오는 세포 방해를 최소화한다. 교정판을 포함하는 유틸리티 플레이트를 분석 판으로 교체하고 분석을 계속합니다. 분석이 완료되면 센서 카트리지와 플레이트를 제거합니다.
파일을 적절한 대상 폴더에 저장합니다. 이 연구에서는 C 알비칸의 생체 에너지 기능이 추가 플럭스 분석기로 평가됩니다. 미토콘드리아 단백질 mam33이 부족한 돌연변이는 또한 산소 소비율 및 세포외 산성화율에 미토콘드리아 단백질의 삭제효과를 연구하기 위한 보완균질과 함께 포함되어 있습니다.
C 알비칸 야생 유형은 분당 145피코몰의 산소 소비율을 나타내며, 이는 세포외 플럭스 분석에 대한 최적의 범위 내에 있습니다. 야생형, 맘33 돌연변이 및 맘33의 기저 산소 소비율은 균주를 보완하여 차이가 없다. 유사 하 게, 유의 한 차이 균주 사이 기저 세포 외 산성화 속도에서 볼 수 없습니다.
그러나, 시안화칼륨, 야생형 및 맘33 돌연변이를 함유한 복합IV를 억제함으로써, 맘33의 보완균주는 글리코리시스쪽으로 상당한 변화를 보여준다. mam33 돌연변이 균주는 그러나 화합물 IV 의존경로가 이 긴장에서 손상되었다는 것을 건의하는 보상 적인 당분해변을 보여주지 못했습니다. 글리코리스틱 스트레스 테스트에서 세포는 1시간 동안 포도당을 굶주리고 기저 산소 소비율및 세포외 산성화율을 측정한다.
기아 시, mam33 돌연변이 균주는 다른 균주에 비해 상당히 낮은 산소 소비와 세포외 산성화 비율을 보여줍니다. 이것은 세포가 기아 조건에 강요될 때 호흡과 글리코리시둘 다에 대한 포도당의 손상한 이용을 건의합니다. 포도 당을 주입 한 후, 모든 균주는 산소 소비 속도와 세포 외 산성화 속도 모두의 자극을 보여줍니다.
분석 판의 코팅은 칸디다 알비칸스 세포가 플레이트에 부착 할 수 있습니다. 칸디다 알비칸스 세포의 부적절한 준수는 분석 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 기술의 발달 후에, 그것은 생리적이고 병리학적인 조건 도중 미토콘드리아가 어떻게 작동하는지 를 해결하는 세포 모형 및 질병의 넓은 범위에서 채택되었습니다.
예를 들어, 이 분석에서 환자 유래 및 제어 세포를 채용하는 것은 미토콘드리아 기능이 어떻게 변경되는지에 대한 구체적인 질문을 해결할 수 있다. 이러한 화합물은 매우 유독하기 때문에 시안화 칼륨 및 항마이신 A와 같은 미토콘드리아 억제제를 준비하는 동안 주의해야 한다.
