Este protocolo es significativo para determinar la función glucolítica y la respiración mitocondrial en Candida albicans. La principal ventaja de esta técnica es que permite medir la función mitocondrial sin necesidad de purificar las mitocondrias de Candida albicans. Este método se puede optimizar para investigar los efectos de la manipulación genética o moduladores químicos en las vías mitocondriales y glucolíticas en Candida albicans u otros patógenos fúngicos.
Esta técnica es relativamente simple. O dependiendo del organismo, su uso puede ayudar a optimizar el número de células y la concentración de inhibidores mitocondriales en su ensayo. En una campana de flujo laminar, disolver Poli-D-lisina en el agua de la rejilla de tejido a una concentración final de 50 microgramos por mililitro.
Mezcle bien la solución y aliquotándola en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, asegurándose de alicuervar al menos 1,3 mililitros por tubo. Añadir 50 microlitros de esta mezcla a cada pozo de la placa de ensayo, cubrir la tapa e incubar a temperatura ambiente durante una o dos horas. A continuación, aspirar la solución.
Enjuague los pozos de la placa de ensayo una vez con 500 microlitros de agua de grado de cultivo de tejido estéril, abra la tapa y deje que los pozos se sequen al aire. Si no utiliza la placa el día que se prepara, guárdela a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos a tres días. El día antes del experimento, abra el kit de ensayo de flujo adicional y retire el contenido.
Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicio. Llene cada pozo de la placa de servicio con un mililitro de calibrador y luego coloque el cartucho del sensor de nuevo. Asegúrese de que los sensores que contienen fluoróforos estén sumergidos en el calibrador.
Incubar el cartucho del sensor a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono durante la noche. El día antes del ensayo, inocular los C albicanos preparados en el caldo YPD y crecer durante la noche a 30 grados celsius en una coctelera a 200 rpm. El día del ensayo, diluir un número adecuado de células en el medio de ensayo para producir una concentración final de 100.000 células por cada 100 microlitros.
Agregue 100 microlitros de las células diluidas en cada pozo de la placa de ensayo excepto los pozos A1, B4, C3 y D6. A estos pozos, agregue sólo 100 microlitros de medio de ensayo para la corrección de fondo. Incubar la placa a 37 grados celsius en una incubadora de dióxido de carbono durante 60 minutos para dejar que las células se adhieran a la superficie de la placa. Preparar los compuestos para el ensayo de función mitocondrial a una concentración de 10 veces en el medio de ensayo correspondiente, tal como se describe en el protocolo de texto.
Añadir 50 microlitros de SHAM en el puerto A, 50 microlitros de oligomicina en el puerto B, 62 microlitros de cianuro de potasio en el puerto C, y 68 microlitros de Antimicina A en el puerto D.Next, preparar los compuestos para el ensayo de tensión glucolítica a 10 veces concentración en el medio de ensayo correspondiente descrito en el protocolo de texto. Agregue 50 microlitros de glucosa al puerto A, 55 microlitros de oligomicina en el puerto B, 62 microlitros de 2-DG en el puerto C y 68 microlitros de Antimicina A al puerto D.Antes del ensayo, abra el analizador de flujo adicional y configure la plantilla de ensayo utilizando la pestaña del asistente de ensayo. Siga las instrucciones paso a paso y rellene toda la información que aparece durante la configuración.
Genere un diseño de grupo y configure el protocolo como se describe en el protocolo de texto. Guarde estos diseños antes del ensayo. En el momento del ensayo, restaure el protocolo guardado abriendo el archivo correspondiente en la opción abrir archivo en la pestaña del asistente de ensayo.
A continuación, cargue los compuestos 10X en los puertos respectivos del cartucho del sensor hidratado que contiene el calibrador. Cargue el cartucho del sensor en la bandeja portadora del analizador de flujo adicional. Inicie la calibración haciendo clic en el botón de inicio de la pantalla.
A continuación, agregue suavemente 350 microlitros del medio de ensayo a la placa celular a lo largo del lado de las paredes para minimizar la perturbación celular, lo que eleva el volumen final a 450 microlitros. Sustituya la placa de utilidad que contiene el calibrador por la placa de ensayo y continúe con el ensayo. Una vez completado el ensayo, retire el cartucho del sensor y la placa.
Guarde el archivo en la carpeta de destino adecuada. En este estudio, las funciones bioenergéticos de los C albicans son evaluadas por un analizador de flujo adicional. También se incluye un mutante que carece de la proteína mitocondrial mam33 junto con su cepa de complemento para estudiar los efectos de la deleción de una proteína mitocondrial en la tasa de consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular.
El tipo salvaje C albicans muestra una tasa de consumo de oxígeno de 145 picomoles por minuto que está dentro del rango óptimo para cualquier ensayo de flujo extracelular. La tasa de consumo basal de oxígeno del tipo salvaje, mamelado33 mutante y mam33 cepas complementadas no muestran diferencias. Del mismo modo, no se observan diferencias significativas en las tasas basales de acidificación extracelular entre las cepas.
Sin embargo, al inhibir complejo-IV con cianuro de potasio, el tipo salvaje y mam33 mutante, cepas complementadas mam33 muestran un cambio significativo hacia la glucólisis. Sin embargo, la cepa mutante mam33 no mostró un cambio glucolítico compensatorio que sugiere que la vía dependiente del compuesto IV está deteriorada en esta cepa. En la prueba de esfuerzo glucolítico, las células se mueren de hambre de glucosa durante una hora y se mide la tasa de consumo basal de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular.
Tras el hambre, la cepa mutante mam33 muestra un consumo de oxígeno significativamente menor y tasas de acidificación extracelular en comparación con las otras cepas. Esto sugiere un deterioro de la utilización de glucosa para la respiración y la glucólisis cuando las células se ven forzadas a la condición de inanición. Después de inyectar glucosa, todas las cepas muestran estimulación tanto de su tasa de consumo de oxígeno como de su tasa de acidificación extracelular.
El recubrimiento de la placa de ensayo permite que las células de Candida albicans se adhieran a la placa. La adherencia incorrecta de las células albicans de Candida afectará el resultado del ensayo. Después del desarrollo de esta técnica, se ha empleado en una amplia gama de tipos de células y enfermedades que abordan cómo funcionan las mitocondrias durante las condiciones fisiológicas y patológicas.
Por ejemplo, empleando células derivadas del paciente y de control en este ensayo, es posible abordar las preguntas específicas de cómo se altera la función mitocondrial. Se debe tener cuidado mientras se preparan inhibidores mitocondriales como el cianuro de potasio y la antimicina A, ya que estos compuestos son extremadamente venenosos.
