Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de Candida sur la virulence des souches et les contributions de gènes spécifiques à ces processus. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle évite les préoccupations concernant l’utilisation des animaux, est robuste, rapide, bon marché, et fournit un grand nombre d’animaux par expérience. D’une manière générale, les personnes qui sont nouvelles à cette méthode auront probablement du mal un peu parce qu’ils auront une certaine difficulté à évaluer la viabilité du ver avant le début de l’expérience ou ils pourraient avoir quelques problèmes avec l’injection incohérente des vers.
Commandez des larves auprès de grossistes et de fournisseurs qui n’introduisent pas d’hormones, d’antibiotiques ou d’autres traitements aux larves et qui sont en mesure d’expédier et de livrer des spécimens vivants. Lorsque les larves arrivent, vérifiez chaque récipient pour confirmer la santé et la viabilité des larves. Les larves en bonne santé seront complètement submergées sous la literie, se déplaçant et possédant une coloration jaune et bronzée légère avec peu de larves contenant des marques noires ou des décolorations le long du corps.
Les larves peuvent être stockées dans leurs contenants dans un espace ventilé à température ambiante jusqu’à deux semaines. Pour préparer les cellules à levures à l’infection à Galleria mellonella, faire pousser les souches de C.albicans à injecter pendant la nuit dans trois millilitres de bouillon frais levure-peptone-dextrose par souche dans des tubes de culture standard sur un tambour rotatif à vitesse moyenne et 30 degrés Celsius. Le lendemain matin, recueillir les cellules par centrifugation, et laver la levure trois fois en cinq millilitres de pbs frais pour centrifugation.
Après le dernier lavage, resuspendre les cellules dans un millilitre de PBS frais et transférer la levure dans un tube de microcentrifugeuse. Diluer périodiquement les cellules dans des concentrations supplémentaires de PBS à 1 à 100, 1 à 1000 et une à 100 000, et compter les cellules des dilutions une à 100 et une à 1000. Réglez les cellules à 2,5 fois 10 à la septième cellule par millilitre de concentration de PBS dans un nouveau tube de microcentrifugeuse, et confirmez l’exactitude de la dose infectieuse en plafonnant le volume approprié de la dilution d’un à 100 000 pour atteindre 100 unités formant des colonies sur une plaque dextrose de levure-peptone-dextrose pour chaque culture à utiliser dans l’infection.
Pour infecter les larves avec les cellules de Candida, d’abord répandre une petite quantité de litière de ver de cire dans une boîte de Pétri stérile vide de 100 par 15 centimètres par réplique biologique, et stériliser une seringue de 10 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 26 trois fois avec 10 microlitres de 70% d’éthanol et trois fois avec 10 microlitres de PBS par lavage. Ensuite, vortex la dilution de l’inoculation de C.albicans, et charger 10 microlitres de cellules dans la seringue. Ouvrez un récipient de larves de G.mellonella, et utilisez un doigt pour retourner soigneusement la literie pour découvrir les larves, en sélectionnant des larves jaunes bronzées d’une taille similaire qui sont en bonne santé avec un manque de pigmentation noire sur le corps, en utilisant le milieu et les index et le pouce pour ramasser une larve d’une manière similaire à saisir un crayon.
Rouler la larve sur son dos de sorte que les jambes sont orientées vers le haut, tenant toute la longueur du corps entre les doigts et le pouce de sorte que la larve est incapable de se courber ou de s’éloigner de l’injection. D’autre part, faites pivoter la seringue de sorte que le biseau de l’aiguille est orienté vers le haut, et insérez lentement toute la longueur du biseau dans le corps à la jonction avec la jambe gauche arrière, en veillant à ce que l’aiguille pénètre dans le corps et ne pousse pas simplement le corps de la larve vers l’intérieur. L’étape la plus critique dans cette procédure est l’injection du ver de cire de telle sorte que les dommages au corps larvaire est minimisé et le bolus complet est inoculé.
Injectez ensuite les 10 microlitres de Candida inoculum et extrayez l’aiguille. Co-maison jusqu’à 10 larves injectées de la même culture Candida dans chaque plat petri de 100 x 15 millimètres après l’inoculation, et incuber la larve à 37 degrés Celsius pendant huit jours. Vérifiez la vaisselle toutes les 24 heures pour surveiller la mort.
La mortalité peut d’abord être évaluée par pigmentation assombrie, la formation de taches noires ou de corps, et un manque de mouvement. Pour confirmer la mortalité, utilisez des pinces à épiler pour rouler doucement les larves moribondes sur leur dos et piquer légèrement le dessous de la larve avec les pinces à épiler. Les larves qui commencent à se puper dans les papillons de nuit peuvent être incluses dans l’analyse, mais devraient être enlevées si elles commencent à muer.
Il n’existe aucune différence significative dans la cinétique de la mort de G.mellonella entre les larves infectées zéro ou 10 jours après leur arrivée. Les signes caractéristiques de la maladie apparaissent chez les larves des deux âges qui succombent à l’infection, en commençant par la décoloration qui cède la place à des taches noires avant une perte totale de motilité et éventuellement la mort. L’infection par C.albicans accélère ce processus de décoloration et de morbidité, mais ne modifie pas significativement la cascade de marqueurs phénotypiques conduisant à la mort par rapport aux larves non infectées ou injectées par PBS.
Notamment, l’infection de G.mellonella par des homo-ou hétérozygotes de type accouplement provenant de l’une ou l’autre des souches c.albicans cliniquement isolées testées produit des taux élevés de mortalité par rapport aux animaux injectés par PBS, tandis que les injections de souches dérivées prototrophiques atténuent l’effet mortel de ce modèle. Il est important de se rappeler de choisir des larves saines et d’être doux dans la manipulation des larves. Si plusieurs souches sont inoculées, prenez soin de ne pas laisser les cellules De Candida s’asseoir dans le PBS trop longtemps.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le profilage immunologique et la localisation de Candida chez les larves peuvent être effectuées pour répondre à d’autres questions sur les interactions entre l’hôte et l’agent pathogène fongique lors d’une infection. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer la pathogénie candida à l’aide de formats à haut débit. N’oubliez pas que travailler avec Candida albicans exige des soins et que des précautions standard, y compris l’usure de l’équipement de protection personnelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
