この方法は、株毒性とこれらのプロセスに対する特定の遺伝子の寄与に関するCandida分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、動物の使用に関する懸念を避け、堅牢で、速く、安価であり、実験ごとに多くの動物を提供することです。一般的に言えば、この方法に新しい個人は、実験の開始前にワームの生存率を評価するのが難しいか、ワームの一貫性のない注入に問題がある可能性があるため、少し苦労する可能性があります。
ホルモン、抗生物質、その他の治療法を幼虫に導入せず、生きた標本を出荷して配達できる卸売業者やサプライヤーから幼虫を注文してください。幼虫が到着したら、各容器を確認して、幼虫の健康状態と生存率を確認します。健康な幼虫は寝具の下に完全に沈み、動き、体に沿って黒い跡や変色を含む幼虫が少ない黄色の薄い日焼け色を持っています。
幼虫は、最大2週間の周囲温度の換気された空間で容器に保管することができます。ガレリアメロネラ感染のために酵母細胞を調製するために、C.albicans株を中速および摂氏30度の回転ドラム上の標準的な培養管の1株当たり3ミリリットルで一晩注入する増殖させる。翌朝、遠心分離により細胞を採取し、1回の新鮮なPBS遠心分離を5ミリリットルで酵母を3回洗浄する。
最後の洗浄後、新鮮なPBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、酵母をマイクロ遠心分離チューブに移します。1対100、1対1、000、および1対100、000濃度で細胞を追加のPBSで連続して希釈し、1対100および1対1、000希釈から細胞を数える。新しいマイクロ遠心分離管中のPBS濃度の1ミリリットル当たりの7番目の細胞に細胞を2.5倍に調整し、各培養物に使用される1つの酵母ペプトンデキストロースアガープレートで100個のコロニー形成ユニットを達成するために、1〜100,000希釈の適切な体積をめっきすることによって感染量の精度を確認する。
幼虫をカンジダ細胞に感染させるために、まず少量のワックスワーム寝具を生物学的複製ごとに1つの空の100〜15センチメートルの無菌ペトリ皿に広げ、10マイクロリットルの注射針を3回26ゲージの注射針を3回殺菌し、10マイクロリットルのエタノールを10マイクロリットルで3回殺菌する。次に、C.albicansの接種希釈を渦液、そして10マイクロリットルの細胞をシリンジにロードする。G.mellonella幼虫の容器を1つ開き、指を使って慎重に寝具をひっくり返して幼虫を発見し、中指と人差し指と親指を使って鉛筆をつかむのと同じように1つの幼虫を拾い上げ、体に黒い色素沈着の欠如を伴う健康な同じ大きさの黄色い日焼けした幼虫を選択します。
幼虫が背中に転がして脚を上に向け、体の全長を指と親指の間に保持して、幼虫がカールしたり、注射から引き離したりできないようにします。一方、針のベベルが上向きになるように注射器を回転させ、後方の左脚との接合部でベベルの全長をゆっくりと体に挿入し、針が体に浸透し、単に幼虫の体を内側に押し込まないようにします。この手順で最も重要なステップは、幼虫の体への損傷が最小限に抑え、完全なボーラスが接種されるような方法でワックスワームの注射です。
その後、カンディダ接種の完全な10マイクロリットルを注入し、針を抽出します。接種後の100%15ミリメートルのペトリ皿に同じカンジダ文化から注入された最大10匹の幼虫を共同収容し、8日間摂氏37度で幼虫をインキュベートします。24時間ごとに料理をチェックして死を監視してください。
死亡率は、最初は暗い色素沈着、黒い斑点または身体の形成、および動きの欠如によって評価することができる。死亡率を確認するには、ピンセットを使用してモリバンドの幼虫を背中にそっと転がし、幼虫の下側をピンセットで軽く突きます。蛾に子犬を開始する幼虫は、分析に含めることができますが、彼らは溶融し始める場合は除去する必要があります.
到着後0日または10日後に感染した幼虫の間には、G.メロネラ死の運動に有意な差は存在しない。病気の特徴的な徴候は、運動性の完全な喪失と最終的には死の前に黒い斑点に道を与える変色から始まり、感染に屈する両方の年齢から幼虫で生じる。C.albicansの感染は、変色と罹患率のこのプロセスをスピードアップしますが、感染していないまたはPBS注射された幼虫と比較して、死につながる表述語マーカーのカスケードを有意に変化させるものではありません。
特に、検査された臨床的に単離されたC.albicans株のいずれかから交配型のようなホモまたはヘテロ接合性を有するG.mellllellaの感染は、PBS注入動物と比較して高い死亡率を生み出し、原始性誘導体株の注射はこのモデルの致死的効果を減衰させる。健康な幼虫を選び、幼虫の扱いに優しくすることが重要です。複数の株が接種される場合は、カンジダ細胞があまりにも長い間PBSに座らせないように注意してください。
この手順に従って、免疫学的プロファイリングや幼虫内のカンジダの局在化のような他の方法を実行して、感染時の宿主病原体と真菌病原体との相互作用に関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、研究者がハイスループット形式を使用してカンディダ病原発病を探求する道を開きました。Candida albicansで作業するには注意が必要であり、個人保護機器の摩耗を含む標準的な予防措置は、この手順を実行する間、常に取られるべきであることを忘れないでください。
